一种提高数据均一性的RAD建库方法

摘要

本发明公开了一种提高数据均一性的RAD建库方法。它包括内切酶的选择消化、磁珠纯化和筛选、末端修复加A碱基、加测序接头、磁珠纯化、PCR扩增、样品浓度检测、样品混池。本发明方法PCR扩增效率高，得到的DNA测序数据均一性好，可以满足自然群体或者家系的遗传学分析。

主权项

一种提高数据均一性的RAD建库方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在0.2ml PCR管中取总量1ug、浓度为25ng/ul、体积40ul的基因组DNA样本，加入1ul DNA II型限制性内切酶、5ul内切酶缓冲液、4ul去离子水，在37℃孵育15分钟，然后65℃孵育15分钟；(2)将步骤(1)的酶切产物补去离子水至100ul，加入45ul的DNA纯化磁珠，漩涡混匀，室温静置5分钟，然后将0.2ml PCR管置于磁力架上，待液体澄清，将上清液转移至新的0.2ml PCR管，加入20ul DNA纯化磁珠，室温静置5分钟，加入当天配置的80％乙醇清洗磁珠两遍，弃掉上清液，让磁珠风干，然后用55.5ul的不含核酸酶的去离子水洗脱DNA；(3)向步骤(2)得到的DNA中加入3ul末端修复加A碱基的混合酶液和6.5ul末端修复加A碱基酶缓冲液，在20℃孵育30分钟，65℃孵育30分钟；(4)向步骤(3)得到产物中加入15ul TA连接酶混合液、2.5ul DNA测序接头和1ul增强连接混合液，20℃孵育15分钟，然后用DNA纯化磁珠纯化产物；(5)取出步骤(4)中得到的产物15ul到新的0.2ml的PCR管中，再加入25ul的PCR高保真聚合酶混合液、5ul PCR特异性引物和5ulPCR通用引物，混匀后置于PCR仪上进行反应；(6)向步骤(5)中加入DNA纯化磁珠进行纯化；(7)向步骤(6)中得到的DNA用特异性荧光定量仪进行浓度测定；(8)根据PCR特异性引物的种类和样品的浓度以及测序要求的数据量来确定不同的样品混池的个数和质量比。