鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法

摘要

本发明公开一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法。该方法以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端加入酶切位点和组氨酸标签，并亚克隆至组成型表达载体pGAP9K以构建重组质粒，酶切线性化后电转化毕赤酵母，筛选阳性克隆转化子，接种至发酵培养基进行液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。本发明首次在毕赤酵母中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定，易于纯化，可应用于食品、医药等领域，为AMP脱氨酶的工业化生产奠定了基础。

主权项

鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的毕赤酵母真核表达方法，其特征在于具体步骤如下：(1)鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，在其两端均加入EcoRI酶切位点和组氨酸标签，纯化回收PCR产物；(2)重组表达载体的构建将组成型表达载体pGAP9K和步骤(1)所得PCR产物分别用EcoRI酶切纯化，连接所得酶切产物并转化E.coli JM109，筛选阳性克隆菌株；(3)线性化重组质粒对毕赤酵母的电转化以及阳性克隆转化子的筛选提取步骤(2)所得阳性克隆菌株质粒，经SacI线性化后电转化Pichia pastoris GS115，使用步骤(1)所述引物对筛选阳性克隆转化子；(4)重组菌的摇瓶发酵培养将步骤(2)所得阳性克隆转化子接种至YPD培养基进行种子培养，取对数生长期24h的种子液以体积比3％的接种量接种至液体发酵培养基，于30℃、200r/min摇瓶发酵培养96h，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物；所述液体发酵培养基成分如下：甘油2wt％，蛋白胨2wt％、酵母膏1wt％、KH₂PO₄0.5wt％，MgSO₄·7H₂O 0.05wt％，pH值为6.0；步骤(1)所述鼠灰链霉菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)MCCC No.1A01641。