鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法

摘要

本发明公开一种鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法。该方法以鼠灰链霉菌基因组为模板，设计特异性引物扩增AMP脱氨酶基因序列，在其两端分别引入酶切位点，并亚克隆入表达载体pKLAC1构建得到重组质粒，酶切线性化后电转化乳酸克鲁维酵母，筛选阳性克隆转化子，再利用pKLAC1通用引物筛选出多拷贝转化子，最后经种子培养和液体发酵培养，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。本发明首次在乳酸克鲁维酵母中成功表达了鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶，实验结显示该重组酶具有较高的酶活，且酶活性稳定，可应用于食品、医药等领域。

主权项

鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的乳酸克鲁维酵母真核表达方法，其特征在于具体步骤如下：(1)鼠灰链霉菌AMP脱氨酶基因的克隆以鼠灰链霉菌基因组为模板，以序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的引物对通过PCR特异性扩增AMP脱氨酶基因，在其两端分别引入XhoI和BglII酶切位点，纯化回收PCR产物；(2)重组表达载体的构建将表达载体pKLAC1和步骤(1)所得PCR产物分别用XhoI和BglII双酶切，连接所得酶切纯化产物并转化E.coli JM109，筛选阳性克隆菌株；(3)线性化重组质粒的电转化及转化子的筛选提取步骤(2)所得阳性克隆菌株质粒，经BstXI线性化后电转化Kluyveromyces lactis GG799，使用步骤(1)所述引物对筛选阳性克隆转化子，再利用pKLAC1通用引物进行PCR筛选出多拷贝转化子；(4)重组酶在GG799中的表达将步骤(3)筛选到的多拷贝转化子接种至YPD培养基进行种子培养，再以体积比2％的接种量接种至YPD培养基，于30℃、200r/min条件下进行液体发酵培养120h，取发酵液上清，即得AMP脱氨酶表达产物。