棉花单位点质量基因在染色体的快速定位方法

摘要

本发明涉及一种棉花单位点质量基因在染色体的快速定位方法，属于生物技术领域。利用海陆F₂定位群体构建的近等基因混池，筛选获得具有多态性的引物,而后检测隐性基因混池的9个单株、P‑1、P‑2以及F₁的DNA，逐一记录它们的带型。据此，统计隐性混池的9个单株与隐性亲本P‑1的带型一致的个体数，计算拟合率。选出与P‑1带型拟合率在60%以上，且F₁带型为显性带或共显性带的多态性引物，然后用这少量的似然引物检测F₂分离群体，统计带型，软件分析，即获得与该质量基因连锁的SSR引物。实施例显示，该方法使利用F₂定位群体筛选目标连锁引物的范围缩减达90%以上；可快速锁定与目的质量基因连锁的SSR引物，有效地减轻了基因定位的工作量，极大地提升了质量基因在染色体的定位效率。

主权项

一种棉花单位点质量基因在染色体的快速定位方法，包括：1）F₂定位群体的构建：利用海岛棉、陆地棉杂交F₁，自交获得F₂分离群体；2）DNA的提取：采用棉株小真叶提取亲本及杂交F₁、F₂群体的DNA，如是人工合成的外源质量基因，也可直接以种子提取DNA；3）F₂群体质量基因检测：如是人工构建的外源基因，因已知该基因序列，可设计特征引物对个体DNA做PCR扩增，在F₂群体检测每个个体的目的质量基因，确定F₂定位群体中外源质量基因的理论分离比例；若是天然质量突变基因，在温室或大田依据该突变体的表型性状来鉴定群体中每一个体的显、隐性质量基因的表达，确定F₂定位群体中质量基因的理论分离比例；4）混池构建：在F₂群体根据表型或特异引物鉴定质量基因的分离情况，在该F₂群体中筛选其中10棵显性基因的个体、10棵隐性基因的个体，取其等量DNA混合，构建目的基因的显性混池与隐性混池；5）利用覆盖棉花26条染色体的234对核心引物，引物来自Cotton Marker Database，网址http://www.cottonmarker.org/公布的引物，其引物编号为NAU1067、NAU3911、NAU2083、NAU2419、NAU5107、NAU2182、NAU3690、NAU2095、NAU3254、NAU2896、NAU2858、NAU5383、NAU5384、BNL3971、NAU1072、NAU3485、NAU3189、BNL1897、BNL3259、JESPR231、NAU1070、NAU1179、BNL2443、NAU3639、NAU3479、NAU3172、NAU3083、BNL3089、NAU3592、BNL4047、NAU3491、BNL530、BNL4049、NAU3009、NAU5236、NAU1151、NAU1137、BNL3452、NAU2494、NAU1042、NAU3325、JESPR197、NAU2140、NAU2561、NAU3273、NAU2714、BNL3359、NAU2967、NAU2611、NAU2971、NAU2128、NAU2580、NAU3206、NAU3900、NAU933、NAU3918、NAU2686、NAU3380、MUCS382、MUCS308、NAU5439、NAU5491、NAU2308、NAU3590、NAU3793、CIR343、NAU4080、NAU3964、NAU1369、NAU2407、JESPR232、NAU920、BNL686、JESPR274、BNL1162、NAU2832、NAU1360、BNL1317、BNL2590、NAU2591、NAU2723、NAU5166、NAU3917、NAU3454、NAU2935、BNL1665、NAU5316、NAU3122、NAU1182、BNL2960、BNL1231、NAU3480、BNL1066、NAU2599、BNL1408、NAU3284、BNL3431、NAU1148、NAU2257、NAU2202、NAU3401、NAU3897、NAU4020、NAU3662、NAU3713、BNL598、NAU2030、JESPR300、NAU2285、NAU2038、NAU2300、NAU2871、NAU4104、BNL4029、NAU2893、NAU3723、BNL1707、NAU3464、NAU3573、NAU5465、NAU5027、NAU3913、BNL1059、NAU4009、NAU5499、NAU3903、NAU3346、NAU3714、BNL1667、NAU2985、NAU3496、NAU3576、NAU2901、NAU3040、BNL2440、NAU3424、NAU2597、NAU5152、NAU4956、NAU2627、NAU5061、JESPR297、NAU2974、NAU3608、NAU2898、NAU3292、NAU3257、NAU2325、NAU2909、NAU3800、BNL1606、BNL2496A、NAU2691、NAU2980、NAU3843、NAU4871、NAU3017、BNL1079、BNL3558、NAU2094、NAU3011、NAU3685、NAU3656、NAU2233、NAU3372、BNL852、BNL3811、NAU3698、NAU2650、NAU3183、NAU2503、NAU2776、NAU5307、BNL2570、NAU2579、BNL119、NAU4014、NAU2888、NAU3368、BNL3646、NAU3740、BNL3279、NAU3493、NAU2361、NAU3585、NAU3156、NAU3240、MUSS532、NAU2653、NAU2634、NAU2120、NAU2291、NAU3539、NAU3633、NAU2162、NAU3437、JESPR220、NAU3392、NAU3100、NAU1025、NAU3732、BNL3511、NAU3967、NAU936、NAU3829、NAU5189、NAU864、BNL1646、NAU5335、NAU3224、NAU2439、BNL3860、NAU3786、JESPR308、NAU3010、BNL2597、BNL827、MUSS519、NAU2641、NAU3298、BNL3806、BNL3264、BNL3103、NAU905、BNL3594、NAU3271、NAU4925、NAU4089、NAU3920、NAU2912、NAU2696、BNL3537、NAU3795、NAU3032，采用这234对核心引物对两混池做PCR扩增，筛选在两混池间具有多态性的引物；6）以混池获得的多态性引物，对隐性池的单株、隐性亲本P‑1、显性亲本P‑2以及F₁的DNA样本，做PCR扩增，而后做PAGE凝胶电泳，记录隐性池单株以及P‑1、P‑2、F₁的带型；计数与隐性亲本P‑1带型一致的个体有多少，计算拟合率，公式如下：拟合率=与隐性亲本P‑1条带一致的个体数/总个体数×100%；而后筛选与P‑1带型拟合率在60%以上，且F₁带型为共显性带或显性带的引物；即为与目的质量基因最大可能连锁的目标引物；7）将上述与目的质量基因最大可能连锁的目标引物检测F₂群体的基因型，与“隐性亲本”带型相同的个体基因记为“1”，与“显性亲本”带型相同的的记为“2”，共显性杂合带型记为“3”，缺失记为“0”；通过JionMap4.0软件做连锁分析，确定与目的质量基因连锁的SSR引物，根据目标SSR引物所在的染色体，即将质量基因定位在某一特定染色体上。