一种冷休克蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种冷休克蛋白的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤一，TRIzol法提取总RNA；用研钵磨碎小鼠组织样品，每50‑100mg组织加入1ml裂解液；步骤二，cDNA第一链合成于20μl反应体系中加入5μl RNA溶液、1μl Oligo、1μl dNTP，65℃反应5min；步骤三，于20μl反应体系中加入cDNA1μl、dNTP2μl、TapDNA聚合酶1μl、上下游引物各加1μl、10×buffer2μl；步骤四，重组载体的构建；步骤五，诱导表达；步骤六，初步纯化；步骤七，高度纯化。本发明所制备的冷休克蛋白CIRP对神经组织细胞具有保护作用及抗凋亡作用的效果。

主权项

一种冷休克蛋白的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：步骤一，TRIzol法提取总RNA；用研钵磨碎小鼠组织样品，每50‑100mg组织加入1ml裂解液，PBS漂洗细胞后，加入1ml TRIzol试剂，吹打混匀，移入1.5ml EP管中，然后加入氯仿抽提，用75％的乙醇充分洗涤沉淀，离心后去上清，干燥后用DEPC水溶解，‑70℃保存备用；步骤二，cDNA第一链合成于20μl反应体系中加入5μl RNA溶液、1μl Oligo、1μl dNTP，65℃反应5min，迅速放冰上冷却；再加入4μl buffer、2μl DTT、1μl Rnase inhibitor，37℃反应2min后加入1μl逆转录酶，37℃反应60min；80℃15min终止反应，得到cDNA；步骤三，于20μl反应体系中加入cDNA 1μl、dNTP 2μl、TapDNA聚合酶1μl、上下游引物各加1μl、10×buffer 2μl；95℃预变性5min，然后95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min；步骤四，重组载体的构建，将纯化的PCR产物和pGEX‑4t‑1，分别以EcoR I和Sal I双酶切，经割胶纯化后，将目的基因和pGEX‑4t‑1按5∶1进行连接；反应体系10μl，另加入1μl T₄DNA连接酶，1μl缓冲液液，置于室温2～4小时；将连接产物转化DH5感受态细胞，依次于冰水浴30min，42℃水浴90s及冰水浴2min；加入500μl LB培养基，37℃振荡培养1h；离心后取50μl培养液涂于LB+氨苄青霉素120μg/ml平板，37℃过夜培养；步骤五，诱导表达，挑取单个菌落5ml LB振荡培养过夜，180r/min，37℃；次日转种新鲜LB培养基进行放大培养；当OD₆₀₀值达到0.6～0.7时加入IPTG，于32℃继续培养4h；取诱导前和诱导后细菌离心12000r/min收集菌体，处理后进行10％SDS‑PAGE凝胶电泳；步骤六，初步纯化，蛋白溶液准备，将上步所得菌体加入PH＝7.2，Tris‑Hcl0.1g/ML，超声破碎，12000rpm 4℃离心30min，取上清用0.22mm滤膜过滤除去杂质沉淀；蛋白溶液上阳离子结合柱，收集穿透液，将穿透液上阴离子结合柱，并用0.3mol NaCl洗脱杂蛋白，0.6mol NaCl收集洗脱液；穿透流出液以280nm紫外检测；步骤七，高度纯化：将初步纯化的蛋白溶液上S200分子筛柱，PBE溶液淋洗柱体，分段收集蛋白洗脱液并取样做SDS‑page检验纯度，将高纯度组份合并，真空冻干保存。