一种烟草白粉病菌生理小种的鉴别方法

摘要

本发明公开了一种烟草白粉病菌生理小种的鉴别方法，其中，按照下述步骤操作：A、鉴别寄主(鉴别寄主体系：烤烟品种CF203、G140、K346、净叶黄和晒烟品种塘蓬)的培育和白粉菌的纯化与繁殖；B、接种、调查和抗性类型划分，将烟草白粉病菌纯化后的分离物接种上述5个鉴别寄主；C、DNA提取；D、利用S42寡聚核苷酸随机引物进行PCR扩增DNA；E、电泳检测PCR结果和数据聚类分析；F、分析生物鉴定与S42寡聚核苷酸随机引物PCR扩增DNA数据聚类分析的结果，将烟草白粉病菌划分为不同的生理小种。本发明弥补了烟草白粉病菌生理小种鉴别寄主体系和鉴别方法的空白，为烟草白粉病菌的研究提供了技术支撑，同时为烟草白粉病的防治与抗病育种奠定了理论基础。

主权项

一种烟草白粉病菌生理小种的鉴别方法，其特征在于，按照下述步骤操作：A、鉴别寄主烟苗的培育和分离物的纯化与繁殖：烟苗的培育：将晒烟品种塘蓬，烤烟品种CF203、G140、K346和净叶黄按照常规育苗方法于无菌隔离条件下育苗，培育至7‑8片真叶时备用；白粉菌的纯化与繁殖：新鲜白粉病样品在无烟草白粉病菌的隔离条件下，用病叶样品接种烟草感病品种中烟90烟株，进行纯化，并利用新形成的单个粉孢子堆上的粉孢子进行病菌繁殖，将繁殖所得纯培养用于生理小种的鉴定；B、接种调查和抗性水平划分：采用喷雾接种法接种，接种用粉孢子浓度为1x10⁴～10⁶个孢子/mL，在无烟草白粉病菌的隔离室中，将步骤A中纯化的单个分离物接种到步骤A的5个烟草品种7‑8片真叶期的烟苗，每个供试品种接种15～18株；隔离室温度25℃，相对湿度65％～75％；各品种烟苗随机排列，自然发病后进行观察记载，接种后3周，4周和5周，按照烟草行业白粉病调查分级标准，分别调查记载单片叶片的发病等级，并根据植物病理学病情指数计算公式计算病情指数，根据3次调查的平均病情指数计算得出相对抗病指数；病情指数计算公式：病情指数＝100×∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)相对抗病性评价方法：依据其相对抗病指数1.00，0.60～0.99和＜0.59将抗病类型分别划分为：免疫(I)、抗病(R)和感病(S)；相对抗病指数和相对病情指数的计算方法为：相对抗病指数＝1‑相对病情指数，相对病情指数＝鉴定品种平均病情指数/对照品种平均病情指数(对照品种为发病最严重的品种)；C、DNA提取分离物经纯化后接种烟草感病品种中烟90烟株，从发病严重的烟株上收集白粉病菌粉孢子于1.5mL离心管中，于‑20℃冰箱中贮藏，以备提取DNA；DNA提取采用CTAB法，选用北京艾德莱生物试剂有限公司生产的新型植物基因组DNA快速提取试剂盒提取，研磨前在装有粉孢子的1.5mL离心管中放少许灭过菌的石英砂，利于研磨；用1％的琼脂糖电泳检测DNA质量，将提取好的DNA置于‑20℃冰箱中保存，用于PCR；D、用引物S42进行PCR扩增DNA利用Invitrogen公司生产的S42寡聚核苷酸随机引物，以步骤C中提取的DNA为模板，进行PCR扩增；PCR：PCR所用试剂除引物外，都从北京艾德莱生物试剂有限公司购买，扩增反应总体积为25μL，包括2×PCR Master Mix 12.5μL：Taq DNA聚合酶0.05U/μL、4mmol MgCl₂、0.4mmol dNTPs：dATP、dCTP、dGTP、dTTP，引物5μmol/L 1μL，模板DNA 20‑40ng/μL 1μL，加ddH₂O至25μL；同时以灭菌双蒸水代替模板DNA作为阴性对照；扩增程序为94℃5min，94℃30s、37℃45s、72℃70s，44个循环，72℃7min；E、电泳检测和数据分析：以北京艾德莱生物试剂有限公司生产的5000bp DNA Marker III为分子量标记，取8μL PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶上电泳，经溴乙锭染色后，拍照记录电泳图谱；电泳图谱中的每一条带均作为1个位点，扩增片段的出现与否分别赋值“1”和“0”，制成0‑1矩阵表。然后将制成的0‑1矩阵表输入NTSYS‑PC软件用UPGMA法进行聚类分析，自动生成树状图；F、分析结果并鉴定生理小种：接种同一白粉菌分离物后，5个鉴别寄主为步骤A中所述的五种烟苗，发病情况存在差异，首先计算病情指数，然后计算相对抗病指数，划分不同鉴别寄主对某一白粉病菌分离物的抗病类型，根据5个鉴别寄主对不同白粉菌分离物的抗病类型，初步将白粉菌分离物划分为1‑4号生理小种，然后结合分子生物学鉴定，即利用Invitrogen公司生产的S42寡聚核苷酸随机引物进行PCR扩增DNA的结果进行聚类分析，以遗传相似系数0.83为阈值，将供试菌株划分为4个类群，最终根据生物鉴定和分子生物学试验数据的聚类分析，将白粉病菌进一步划分为1‑6号生理小种：即生物鉴定为同一生理小种类型的，且S42扩增DNA结果的聚类分析聚为同一类的样品，就按生物鉴定划分结果，划分为同一生理小种，即1‑4号生理小种；对于生物鉴定了生理小种类型，但在聚类分析中，未聚为同一类的样品，按照他们是否能够侵染塘蓬品种，分为另外2个生理小种，即5号和6号生理小种。