沙门氏菌鞭毛蛋白衍生物蛋白的生物活性检测方法及其应用

摘要

本发明公开了沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法及其用途，是通过沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力进行体现，以沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性、清除自由基动力学和PDDH自由基的活性作为检测指标。本发明的检测方法稳定，具有测定结果可靠、检测数据重复性较高等优点，测定的结果能较好地反映沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白蛋白的抗氧化和清除自由基的生物活性，并且在对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagell in衍生物蛋白本身以及含有沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物制品的活性跟踪方面具有广泛用途，应用前景广阔。

主权项

沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性检测方法，是通过沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的抗氧化和清除自由基能力进行体现，以沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性、清除自由基动力学和DPPH自由基的活性作为检测指标，包括以下步骤：1)将待检沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白配制成设定浓度的样品溶液；2)检测样品溶液抗氧化和清除自由基的能力；3)计算出检测数据并与沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白的生物活性标准数据比较，得出检测结果；所述沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白包括命名为CBLB502和CZLC331的蛋白；其中，针对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白总的抗氧化活性进行检测，用ABTS法进行检测，包括以下步骤：1)制作标准曲线：按照ABTS检测方法制作ABTS浓度与吸光度A₇₃₅的标准曲线；2)将待测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白样品配成1mg/mL的样品溶液；3)根据标准曲线，按照样品的A₇₃₅值计算样品与Trolox标准溶液的等摩尔浓度，计算出样品的总抗氧化能力；针对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除ABTS自由基动力学活性进行检测，包括以下步骤：1)待测样品溶液准备：将待测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白样品配成0.1mM的样品溶液；2)沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白动态清除ABTS自由基活性检测(1)试剂配制①将ABTS与氧化剂K₂S₂O₈按7mM：28mM终浓度配制成ABTS工作母液后，室温避光存放12‑16小时；②将工作母液用PBS或80％乙醇稀释50，62.5，125，250，375倍成ABTS工作液；(2)测定样品的吸收峰向Eppendorf管中分别加入不同稀释倍数的ABTS工作液0.98mL和0.02mL 0.1mM蛋白溶液，空白对照组中加入0.02mL双蒸水，然后迅速用美国Varian公司的Cary 50UV‑VIS测定340nm和415nm的吸光度，测定时间为0s和30s，0s即未加入样品前，记录不同稀释倍数的ABTS工作液中各个时间点的吸光值A₃₄₀和A₄₁₅；(3)计算清除自由基动力学的最大反应速率通过吸光值A₃₄₀或A₄₁₅与物质的量浓度M换算的标准公式M₃₄₀＝A₃₄₀/ε₃₄₀或M₄₁₅＝A₄₁₅/ε₄₁₅计算得到反应后的物质的量浓度M，其中，ε₃₄₀＝4.8×10⁴(mol/L)^‑1cm^‑1，ε₄₁₅＝3.6×10⁴(mol/L)^‑1cm^‑1；该蛋白清除ABTS自由基的动力学参数为最大反应速率Vmax，通过通用的Hill方程计算不同稀释倍数的ABTS工作液在反应后自由基的浓度M得到；针对沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白清除DPPH自由基的活性进行检测，包括以下步骤：1)将待测沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白样品配成10、25、50、75、100、125μg/mL的样品溶液；用分析纯级的甲醇将DPPH溶解成0.1mM的DPPH自由基溶液；2)六个离心管分别标号，加入等体积470μl的DPPH自由基溶液，然后分别依次加入上述不同浓度的沙门氏菌鞭毛蛋白Flagellin衍生物蛋白溶液，室温下反应5min后于517nm处测定其吸光度，其值分别为空白对照A₀、和样品A₁；3)计算清除羟自由基活性：按下式计算DPPH自由基清除率：DPPH清除比率＝(1‑A₁/A₀)×100％。