一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法

摘要

本发明一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，涉及生物工程领域。其生产工艺流程是秸秆经过粉碎、预湿等预处理工艺，米曲霉经过液体摇瓶培养、一级种子培养、与秸秆混合进行固态发酵，得到含有木质素过氧化物酶的秸秆发酵物，酶活性3～800U/g干发酵物，发酵物经过水提取、分子截留、冷冻干燥可以获得酶制剂粗品,酶活性达到900～8000U/g干粗品。此发酵工艺简便，不会对环境造成污染，也不会对资源造成浪费。采用此方法制得的木质素过氧化物酶可以用于降解木质素大分子结构、释放小分子物质，提高含有木质素秸秆的消化利用率，从而有助于提高秸秆的饲用价值。

主权项

一种米曲霉分泌木质素制备过氧化物酶的方法，其特征在于按照下述步骤进行：以米曲霉为出发菌株，进行试管扩大培养、液体摇瓶培养、一级种子培养和固体发酵培养，得到含有木质素过氧化物酶的米曲霉固体发酵物,然后进行提取得到含有木质素过氧化物酶粗品；其中含有木质素的农作物秸秆原料是选自玉米秸秆、稻草秸秆、麦秸秆、高粱秸秆、大豆秸秆、棉花秸秆中的任意一种，并且秸秆首先经过粉碎，过20～100目的筛；其中所述的试管扩大培养工艺中，其扩大培养基为马铃薯蔗糖培养基；其中所述的液体摇瓶培养和一级种子培养的培养基均为：葡萄糖5～30克，酒石酸铵0.1～5克，苯甲醇0.2～3克，硫酸镁0.2～1克，吐温80 0.5～10克，磷酸二氢钾2～9克，邻苯二甲酸3～18克，加水定容到1升，pH 5～8，120～140℃灭菌20～40分钟；其中所述的液体摇瓶培养工艺条件为，接种一环米曲霉试管斜面孢子于装有体积比16～48%培养基的三角瓶中，在转速：150转/分，25～35℃，培养24～72小时；在进行摇瓶培养之前的试管扩大培养中，首先将米曲霉菌种接入新配置的马铃薯蔗糖培养基中进行培养，培养温度25～35℃，培养时间48～144小时；4～10℃保存备用；其中所述的一级种子培养工艺为，按体积比1～20%的接种量将摇瓶培养种子液接种到一级种子培养基中，在温度25～35℃，搅拌转速50～200转/分，通气量以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比计为0.2～2：1，培养18～72小时；其中所述的固体发酵培养中固体发酵培养基组成为：秸秆10千克，水20～60千克，葡萄糖0.5～3千克，黄豆饼粉0.5～2千克；硫酸铜5～15克，硫酸亚铁5～15克，硫酸锰5～20克，该培养基各成分可以按此比例放大；其中所述的固体发酵培养工艺为：种子液体积/发酵培养基重量比例为2～20%，培养料厚度为0.1～0.4米，料宽0.5～2米，长度不限，通气量按照气体体积/发酵培养基重量/每分钟为0.3～1.5：1，培养时间为3天～23天，中途翻料1～2次；其中生产木质素过氧化物酶粗品的工艺，将固态发酵物培养物粉碎，过20～100目筛，粉碎的发酵培养物与水按1：10～50比例混合，50～300转/分钟搅拌，5～10℃提取4～8小时，抽滤，滤渣用10～50倍的水混合，50～300转/分钟搅拌，5～10℃提取4～8小时，抽滤，两次滤液合并，通过分子量5000～10000的膜截留浓缩50～100倍，‑20℃冷冻干燥，得到酶制剂粗品，由此工艺得到的酶制剂粗品，色质白色至褐色，木质素过氧化物酶活性可达到900～8000U/g干粗品。