一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法

摘要

本发明涉及一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT‑PCR方法，属病毒检测领域。本发明针对4种病毒核苷酸保守区序列设计并合成了特异性引物对CMV‑F/R，PMMoV‑F/R，BBWV‑F/R，TMV‑F/R，并对影响多重RT‑PCR扩增的引物浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行多重RT‑PCR体系的优化，建立能从辣椒组织中同时检测CMV，PMMoV，BBWV和TMV四种病毒复合侵染田间样品的检测方法。本发明提供的多重RT‑PCR检测方法，能够快速、准确又简便和经济的检测出辣椒带毒情况，以便尽早采取有效防治措施，对控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义。

主权项

一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT‑PCR方法，4种辣椒病毒为黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus, PMMoV）、蚕豆萎焉病毒（Broad bean wilt virus, BBWV）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV），其特征在于通过以下步骤实现：（1）提取植物总RNA取大约0.1 g新鲜或冷冻的待测辣椒样品在液氮中研磨至粉末，采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，抽提RNA产物加入DEPC‑ddH₂O溶解，‑70℃保存备用；（2）cDNA的合成以提取的待测辣椒样品的总RNA为模板，反转录制备cDNA模板，反转录体系为20 μL包括：RNA模板2 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 2 μL，10 μmol/L的随机引物2 μL，10×RT mix 2 μL，Quant Reverse Transcriptase 2 μL，RNase‑free ddH₂O 10 μL，反应条件：37 ℃，60 min；（3）多重PCR扩增以合成的cDNA为模板，采用下列4对引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物；第1对引物：CMV‑F/CMV‑RCMV‑F：5′‑AGTCCGTAAAGTTCCTGC‑3′CMV‑R：5′‑TCATGTCGCCAATATCA‑3′；第2对引物：PMMoV‑F/PMMoV‑RPMMoV‑F：5′‑AGAACTCGGAGTCATCGGAC‑3′PMMoV‑R：5′‑GAGTTATCGTACTCGCCACG‑3′；第3对引物：BBWV‑F/BBWV‑RBBWV‑F：5′‑AAATATTAAAACAAACAGCTTTCGTT‑3′BBWV‑R：5′‑TTCAAAGCTCGTGCCATNTYATTKGC‑3′；第4对引物：TMV‑F/TMV‑RTMV‑F：5′‑AGTTGTTGATGAGTTCATGGA‑3′TMV‑R：5′‑GAGGGAAAAACACTATGCGTTATC‑3′；（4）琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物取5μL PCR产物在浓度为15 g/L的琼脂糖1×TAE缓冲系统电泳，EB染色后，使用凝胶成像系统观察并摄影记录结果，根据电泳条带图判定病毒种类，若扩增产物中出现170 bp大小的条带，则样品中含有CMV；若扩增产物中出现576 bp大小的条带，则样品中含有PMMoV；若扩增产物中出现390 bp大小的条带，则样品中含有BBWV；若扩增产物中出现796 bp大小的条带，则样品中含有TMV。