一种二化螟血淋巴细胞的原代培养方法

摘要

本发明公开了一种二化螟血淋巴细胞的原代培养方法。包括如下步骤：（1）配制细胞原代培养液和传代培养液；（2）将二化螟幼虫浸没在乙醇溶液中，进行表面消毒，清洗吸干；（3）将虫体置于用乙醇消毒过的解剖蜡盘中，解剖二化螟；（4）将血淋巴放入盛有HBSS清洗液的细胞培养瓶，静置，待血淋巴细胞贴壁后，吸除HBSS，加入新鲜的HBSS，重复3次；（5）加入细胞原代培养液,放入无光照的细胞培养箱中培养，过夜后，再加入细胞传代培养液；（6）每隔7天吸出和换入细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶。本发明有助于在离体条件下研究二化螟，为其防治途径的研究和开发提供帮助。

主权项

一种二化螟血淋巴细胞的原代培养方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）配制细胞原代培养液和传代培养液；（2）在无菌条件下，将二化螟幼虫浸没在70%或75%乙醇溶液中，进行表面消毒10～20分钟，用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫2～3次，用无菌滤纸吸干虫体或用吹风机吹干虫体；（3）将虫体置于用70%或75%乙醇消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定，解剖二化螟，用20μL移液器吸取血淋巴；（4）将血淋巴放入盛有1mL～2mL HBSS清洗液的T‑25cm²细胞培养瓶，静置15～20分钟，待血淋巴细胞贴壁后，吸除HBSS，加入新鲜的HBSS，重复3次；（5）最后1次去除HBSS后，加入细胞原代培养液1mL,放入无光照的细胞培养箱中27℃培养，过夜后，再加入2mL细胞传代培养液；（6）每隔7天吸出和换入50%～70%量的细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶；所述的细胞原代培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素、两性霉素B和动物血清及饱和苯基硫脲的混合物，pH值为6.0‑6.8；所述的细胞传代培养液是昆虫细胞培养液和动物血清的混合物，pH值为6.0‑6.8；所述的昆虫细胞培养液选自TNM‑FH，所述的动物血清为胎牛血清；所述的细胞原代培养液中青霉素含量为200U/ml，链霉素含量为0.2μg /ml，两性霉素B含量为0.5μg /ml；所述的动物血清体积比含量为10～20%；所述的动物血清体积比含量为10‑20%；所述的饱和苯基硫脲溶液为高压灭菌的苯基硫脲固体过量加入到无菌的TNM‑FN培养液中配制而成。