主权项 |
一种从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法,其特征在于包括以下步骤:(1)获取待分离富集的外周血样,在离心管中颠倒混匀一次,用pH 7.2的PBS磷酸缓冲液1:1稀释得到稀释的血液,稀释时先向管中加入PBS磷酸缓冲液,再加入外周血样;(2)取4个50mL离心管,每个加质量/体积百分比浓度为3.5‑5.0 %的羟乙基淀粉溶液15mL,在羟乙基淀粉溶液中缓慢加入20mL稀释的血液,确保稀释的血液留在羟乙基淀粉溶液上层,室温375‑425r/min,离心30‑35min, 结束后吸取中间白膜细胞层的单个核细胞液,每两管的吸取物合并为一管;(3)取2个新管,每管加入15‑20mL步骤(2)中得到的吸取物,分别用pH 7.2的PBS磷酸缓冲液1:1稀释,室温275‑325r/min,离心15‑20min,弃上清,剩余物用1mL培养液重悬, 培养液组成为每80mL EBM‑2基础培养基中加入FGF2 0.1‑0.2mL、VEGF 0.1‑0.2mL、IGF‑1 0.1‑0.2mL、BMP‑4 0.1‑0.2mL、LiF 0.3‑0.5 mL和GA 0.1‑0.2mL;(4)将8mL培养液加入其中一管,混匀后加入另一管,共10mL悬液;(5)计数;(6)胶原蛋白酶I铺细胞培养瓶: 50μg/mL的胶原蛋白酶I 105μL溶于0.02M的醋酸7.5mL,0.22μm过滤器过滤,铺于T75瓶,37℃1小时,室温1小时,10mLDPBS冲洗2次,加5mL培养液;将步骤(4)得到的10mL悬液注入,48h后半换液一次,操作为抽出7.5mL原培养液,新加入7.5mL培养液,此后每72h半换液一次,培养条件 CO<sub>2</sub>培养箱中37℃、CO<sub>2</sub>浓度5%;(7)传代:细胞增殖至细胞密度为90‑100%时,传至3个培养瓶。 |