一种采用SSR分子标记技术鉴别百合品种的方法

摘要

本发明涉及一种采用SSR分子标记技术鉴别百合品种的方法。结果表明：从13对引物中筛选出2对多态性高、重复性好的引物，共检测出171个片段，其中多态性片段131个，每对引物可以检测出4～22个数目不等的片段，平均1.69个，多态率为76.60%，片段大小介于100～250bp之间；通过NTSYS-pc2.11进行相似系数和聚类分析，遗传相似系数为0.5882～0.9412，平均相似系数为0.7647；聚类分析将此材料划分为6个大类，11份百合种质间的遗传差异与品种特性、花形、花丝和花柱的颜色无相关性，但与花瓣颜色具有一定相关性，通过花色基因能较好地反映百合种质间亲缘关系远近，品种间花色不同，可通过调控花色的相关基因设计引物，为进一步区分亲缘关系远近提供了重要途径。

主权项

一种采用SSR分子标记技术鉴别百合品种的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）准备百合材料：将山丹玫紫、接曼、彩蝶、粉天使、香水白、索拉纳、黑色蒙特、紫衣姑娘、绿百合、加拿大黄、圭亚那这11种百合材料种植于园艺实验站进行常规管理；在苗期随机取每种百合材料20个单株的新鲜叶片混用，液氮冷冻后放入‑70℃超低温冰箱中保存备用；（2）百合DNA的提取：用植物基因组试剂盒提取各种百合材料的DNA，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度；将各材料的DNA浓度稀释至50ng/μL后，置于‑20℃冰箱中备用；（3）SSR引物设计：根据NCBI上搜索的花色基因EST序列，剔除小于20 bp的EST后，对余下的EST—SSR用软件Primer 5.0设计13对百合SSR引物；所述百合SSR引物的长度18～24 bp，GC含量40%～70% ，理论退火温度57.2℃～59.2 ℃，产物长度控制在150～250 bp之间；（4）SSR‑PCR扩增反应、电泳检测：PCR反应体系20μL ，其中，50 ng/μL DNA样品1.5μL， 10µmol·L^‑1正反向引物共1.5μL，10倍的含Mg²⁺的PCR reaction buffer，2.0μL、25 mmol·L‑1 dNTP，rTaq 0.75U，加超纯水至 20 µL；PCR 的反应程序：94℃变性1.5 min，94℃ 变性 30 s，退火30 s，32 个循环，72℃ 延伸 30 s，72℃ 延伸 5 min，4℃保存；PCR 扩增产物中加入6倍的Loading buffer 2.0μL，取2.5μL上样，用 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色；所述引物如下所述：FL1，F：GCAGTGTCTTAGGGTGGTCAA，R:GAGGATGCGAGATTCAGAGG；FL2，F:GCTCTTGGAGGGAGAAGGC，R:GGTTGTACGGCACGCTGAT；FL3， F:CGTTATGCGTTGGTGATACTTT，R:GAGGATGCGAGATTCAGAGG；FL4， F:GACTTCTCCGGGAGTTCGT，R:CATTGGGACAGTGTTTAGCG；FL5，F:CCCCTCGGATCGAAGAAG，R:TCAGTGACTAGGAGCTACCAGAAT；FL6，F:GAATGCAGTGTCTTAGGGTGG，R:GAGGATGCGAGATTCAGAGG；FL7，F:CCTCGGATCGAAGAAGGATR:TCAGTGACTAGGAGCTACCAGAAT；FL8，F:TTAAGCTGGCAGGCAAGAA，R:CATTGGGACAGTGTTTAGCG；FL9，F:GCAGTGTCTTAGGGTGGTCAA，R:TGCAGCTTCCCAGTGGTC；FL10，F:TCAGACTTCCTCCATCATACTTG，R:CATTGGGACAGTGTTTAGCG；FL11，F:TGCTGCTCAGACTTCCTCCA，R:TCAGTTGACCACCCTAAGACACT；FL12，F:AAATTAGGCGTTAATCGTGTTC，R:TGTCCGGTCAGGTTAGTCCA；FL13，F:GACTTCTCCGGGAGTTCGT，R:ACTGTAGCGGTTCATTTGTCTG；（5）统计分析：拍照并读带，有带记为1，无带记为0，缺失记为9，统计扩增情况，用NTSYS‑pc2.11按照类平均法进行聚类分析，构建分子进化系统树；（6）结果与分析：（6A）采用改良CTAB法提取的百合DNA条带清晰明亮，无降解现象，DNA完整性好，分光光度计检测发现A_260/280比值在1.8～2.0之内，浓度在318～684 ng/μL，均能满足PCR的要求；（6B）根据SSR分析结果，计算出11个百合品种间的遗传相似系数，其中对13对引物进行多态性分析，选出2对带型稳定、多态性高重复性好的引物；共检出171个片段，其中，多态性片段131个，占总数的76.60%；每对引物可以检出4～22个数目不等的片段，平均每对引物扩增出1.69条带，片段大小介于100～250bp之间；结果表明，不同引物产生的条带数不同和多态性差异，其中，扩增多态性最好的引物为FL8和FL10；（6C）各品种间遗传距离在0.5882～0.9412之间，绿百合、圭亚那和加拿大黄之间的遗传相似系数最小，为0.5882；彩蝶、粉天使与山丹玫紫、索拉纳和黑色蒙特、接曼、香水白与粉天使遗传相似系数最大，为0.9412，11个品种的平均遗传相似系数为0.7647；（6D）聚类分析结果表明：将11个百合品种分为六大类，以加拿大黄为第Ⅰ大类，以圭亚那为第II大类，以紫衣姑娘为第III大类，以绿百合为第IV大类，以接曼、香水白为第V大类，其余的黑色蒙特、索拉纳、彩蝶、粉天使和山丹玫紫为第VI大类；花色相似的聚为一类，与遗传相似系数的分析结果一致。