N-酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶AiiO的高效生产方法及检测

摘要

本发明涉及N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)酰基转移酶AiiO的高效生产方法及检测，通过构建能够表达AHL酰基转移酶的基因重组菌，对该酰基转移酶利用复合自诱导培养基及变温分批发酵方式进行发酵罐水平的高效发酵，得到高酶活力的发酵液及高比活力的AHL酰基转移酶；利用Quantity one软件对蛋白定量分析，能够快速地对发酵过程不同时间细胞内AHL酰基转移酶总浓度进行准确定量；同时本发明还构建了专用于该酶活力检测的体系，实现准确快速检测酶活力的目的。本发明可以降低AHL酰基转移酶的生产成本，实现AHL酰基转移酶的高效生产，同时对发酵过程中AHL酰基转移酶的浓度及纯化后AHL酰基转移酶的活力进行准确快速的测定，该酶可作为一种新型的病害防治酶制剂使用。

主权项

N‑酰基高丝氨酸内酯酰基转移酶AiiO的高效生产方法及检测，其特征在于，包括以下步骤：S1：构建含aiiO基因的重组表达载体；S2：将重组表达载体转化大肠埃希氏菌得到重组菌；S3：利用重组菌进行发酵罐高密度发酵，培养过程中采用复合自诱导培养基，获得重组蛋白AiiO；利用Quantity One软件，测定发酵过程中不同时间细胞内AiiO全蛋白表达量；S4：利用镍亲和层析对重组蛋白AiiO进行纯化；S5：建立酶活力测定体系，用反相高效液相色谱测定AHL酰基转移酶活力；高密度增殖培养基组成为：Na₂HPO₄ 2～5g/L，KH₂PO₄ 2～5g/L，NH₄Cl 2～4g/L，Na₂SO₄ 0.5～1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3～0.8g/L，FeCl₃·6H₂O 0.01～0.05g/L，葡萄糖4～6g/L，六水琥珀酸钠2～4g/L，二水柠檬酸钠0.2～0.4g/L；复合自诱导培养基组成为：蛋白胨10～20g/L，酵母粉5～10g/L，Na₂HPO₄ 2～5g/L，KH₂PO₄ 2～5g/L，NH₄Cl 2～4g/L，Na₂SO₄ 0.5～1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3～0.8g/L，FeCl₃·6H₂O 0.01～0.05g/L，甘油4～25mL，葡萄糖0.3～1g/L，α‑乳糖1～3g/L，六水琥珀酸钠3～8g/L，二水柠檬酸钠0.2～0.4g/L。