一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法

摘要

本发明公开一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，具有高生长速率的微藻隐甲藻ATCC 30556基因删除突变株的方法。其特征是包含如下步骤：(1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco基因的克隆；(2)用于同源双交换整合的基因片段的构建；(3)Rubisco基因的删除和突变株的构建；(4)隐甲藻Rubisco基因删除突变体生长特性的比较分析。利用本发明的方法定点敲除隐甲藻的Rubisco基因，能够获得异养培养条件下具有高生长速率的隐甲藻突变株，为二十二碳六烯酸(DHA)高效发酵菌种的优化筛选提供了一种新方法。

主权项

一种高生长速率的隐甲藻突变株的构建方法，其特征是包含如下步骤：1)隐甲藻光合作用相关基因核酮糖1，5‑二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco的克隆：采用隐甲藻的Rubisco序列(EB086308.1)设计上游引物和下游引物，以隐甲藻的cDNA为模板进行PCR，纯化目的片段，连入pTZ57R/T载体(Thermo Fisher Scientific)并测序；2)用于同源双交换整合的基因片段的构建：①隐甲藻Rubisco基因上游片段的扩增：以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因上游片段的上游引物、下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段；②隐甲藻Rubisco基因下游片段的扩增：以隐甲藻基因组为模板，Rubisco基因下游片段的上游引物、下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得隐甲藻Rubisco基因的上游片段；③潮霉素抗性基因片段的扩增：以pCAMBIA1301植物表达载体为模板，hpt上下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得潮霉素抗性基因片段；④用于同源双交换删除Rubisco基因的DNA片段的构建：以隐甲藻Rubisco基因上游片段、隐甲藻Rubisco基因下游片段、以及含有hpt基因的DNA片段模板，进行融合PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，经DNA纯化试剂盒纯化，获得目的片段。3)Rubisco基因的的删除和突变株的构建：①隐甲藻感受态细胞的制备：取隐甲藻悬浮培养48h的细胞10mL，4℃,3500rpm离心5min，弃上清，加入1mL 25mM DTT溶液，30℃水浴15min，离心5min，弃上清，10mL 1M山梨糖醇(sorbitol)清洗细胞三次，1mL山梨糖醇重悬细胞备用；②隐甲藻感受态细胞的转化：在无菌条件下取200μL隐甲藻感受态细胞置于2mm电极杯中，加入1μL鲑鱼精DNA和2μg目的片段混匀，冰浴5min，电击转化条件为2.0kV，电阻200Ω，电容25μF，电击之后冰浴5min，加入2mL新鲜液体C9N2培养基，25℃，180rpm震荡复苏48h，取50μL细胞悬浮液均匀图涂布在含有40mg/L潮霉素B的固体C9N2培养基平板上，倒置培养2周，将平板上长出的单克隆细胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上划线，进行转化子的复筛，待长出单克隆细胞，转接液体培养，并进行突变体鉴定；4)删除突变体的分子生物学鉴定：分别提取野生型和突变株隐甲藻细胞的基因组，以hpt基因上下游引物进行PCR，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；5)删除突变体的生长特性分析：所得的隐甲藻突变株M1，M6，M7在C27N7.5的液体培养基中培养，摇床设置参数为转速180rpm，温度25℃；步骤为：接种时取OD_490nm为0.8的新鲜细胞5mL加入20mL培养基中，每组做三个平行样，用UV‑1750分光光度计测定波长为490nm下的吸光值，每12h测量一次，绘制柱状图；可以观察到在液体培养基C27N7.5中，突变株的生长速率比野生株要快。