基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器和测定DNA的方法

摘要

本发明涉及基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器的制备方法及其应用，将发卡DNA1自组装在铂纳米粒子修饰金电极表面，当有目标物DNA2存在时，由于目标物DNA2与组装在金电极表面表面上的发卡DNA1部分互补配对，打开DNA1的发卡结构；然后另外一条发卡DNA3链通过竞争配对杂交取代目标链DNA2，目标链DNA2被释放下来，释放的目标链则继续打开新的发卡结构，如此的循环作用实现了目标链DNA2的循环使用，结合制备的纳米粒子电化学探针实现信号的放大，再利用制备好的电化学传感器催化PAP与PQI之间的循环，实现了电化学信号的进一步放大，利用环伏安法或DPV测定电流信号强度，根据测得电流信号强度，实现对目标链DNA2测定。本发明的传感器具有高的检测灵敏度。

主权项

基于铂纳米粒子催化电化学循环信号放大技术测定DNA的电化学传感器的制备方法和测定DNA的方法，其特征包括以下步骤：(1)铂纳米粒子制备包括以下步骤：把合成要用到的玻璃仪器容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶用王水浸泡洗净，用二次水冲洗烘干后备用；在100mL圆底烧瓶中加入50mL，0.1～50mM的HPtCl₆，并在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入5mL的38.8mM的柠檬酸钠Na₃C₆H₅O₇，此时溶液由黄色变为棕色；再加热10min，搅拌30min，冷却至室温，即得铂纳米粒子PtNPs，转移至棕色瓶中，并放于4℃温度下储存备用；(2)制备铂纳米粒子修饰金电极：取金电极经0.2μm，0.03μm和0.05μm的α‑A1₂O₃抛光粉抛光后，用二次蒸馏水冲洗干净，然后在超声波水浴中超声5min，用高纯氮气吹干；取5～20μL制备的PtNPs滴涂在金电极表面，置于避光处自然晾干，用二次水冲洗电极，得铂纳米粒子修饰的金电极PtNPs/GE；(3)金纳米粒子制备包括以下步骤：把容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶玻璃仪器用王水泡30min，用二次水冲洗烘干后备用；在100mL圆底烧瓶中加入50mL 1mM的HAuCl₄，并在搅拌下加热至沸腾，然后快速加入5mL的38.8mM的柠檬酸钠Na3C₆H₅O₇，此时溶液由无色变为酒红色；再加热10min，搅拌15min，冷却至室温，转移至棕色瓶中，并放于4℃温度下储存备用；(4)二茂铁修饰的金纳米粒子Fc‑AuNPs制备包括以下步骤：把容量瓶、棕色广口瓶、圆底烧瓶制备和储备金属纳米粒子的所用的玻璃仪器用王水浸泡30min，然后用二次水冲洗烘干备用；首先，将1mg Fc加入到含2mL 0.10mol/L NHS和0.10mol/L EDC的0.20mol/LPBS pH 7.40的溶液中，将此混合溶液在室温下剧烈搅拌反应2h；然后向混合溶液中加入2mL金纳米粒子溶液，室温下反应24h后，在13000rpm/min条件下离心30min，沉淀用PBS洗涤三次，以除去未反应的Fc，最后将沉淀用水溶解分散，即得二茂铁修饰的金纳米粒子Fc‑AuNPs；(5)电化学探针制备包括以下步骤：取2mL的样品管，依次加入1.5μL 500mM的Tris‑HCl，6μL 10mM的TCEP，7.2μL 100μM的DNA4,7.2μL 100μM的巯基已胺，室温放置30min后加入1mL制得的Fc‑AuNPs，室温下反应12h；然后在10000r/min下离心30min，弃去上清液，加入800μL Tris‑HCl缓冲液洗3次，并用Tris‑HCl缓冲溶液定容至1mL，即得DNA修饰Fc‑AuNPs探针探针，即电化学探针，4℃储存备用；(6)DNA的预处理：取一定量的0.1～10μM的巯基DNA1或DNA3于2mL离心管中，置于95℃恒温水浴槽中加热5min，取出后立即置于冰水中冷却1min即得到发卡DNA1或DNA3；(7)制备电化学传感器：取5～30μL经过预处理的发卡DNA1滴涂在PtNPs/GE表面，4℃下使其自组装反应24h；接着取10μL 100μM的巯基已醇封闭，得电化学传感器；(8)测定DNA的方法：取5～20μL目标物DNA2滴加到电化学传感器的电极表面，37℃下孵育30min；取5～20μL发卡DNA3滴加到电极表面；37℃下孵育4h，孵育完成后用PBS冲洗两次；最后，取5～50μL制备的电化学探针滴加到电极表面，37℃下继续孵育1h；将电极插入0.5mL 50mM的硼氢化钠，1.75mL 20mM的PNP和3.25mL PBS混合液中，采用三电极系统检测，工作电极为金电极或修饰金电极，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极，利用循环伏安法或DPV测定电流信号强度，根据标准溶液浓度和信号关系作图得标准曲线；所述的DNA1的部分序列为：5’‑SH‑AAA GCC AGT AAT GCC CGG TAG TTA TTC CAT CGT GTA CAA TAA CTA CCG GGC ATA AGA GCA CCC TTG TAC‑3’；所述的DNA2的部分序列为：5’‑CAA TAA CTA CCG GGC ATT ACT GGC CTT‑3’；所述的DNA3的部分序列为：5’‑TAG TTA TTG TAC ACG ATG GAA TAA CTA CCG GGC ATC CAT CGT GTA C‑3’；所述的DNA4的部分序列为：5`‑TTT TTT ATT CGA TCC GGT GCT CTT ATG CCC‑HS‑3`。