RGA法检测重组人促红细胞生成素生物学活性

摘要

一种新的重组人促红细胞生成素(Recombinant Human Erythropoietin，rhEPO)生物活性测定方法。它的基本原理是：利用STAT5的反应元件(sis inducible element，SIE；the gamma response region，GRR；the interferon γ-activated sequence，GAS)构建报告基因载体，转染UT-7细胞，加压筛选和单克隆分离培养得到稳定单克隆细胞株UT-7／G7。rhEPO与配体结合后，经过一系列信号转导，激活报告基因萤光素酶的表达，通过检测rhEPO刺激后萤光素酶表达的变化来对rhEPO活性进行定量。具体检测步骤为：UT-7／G7细胞用DPBS洗3次后，分析培养基培养17-20小时，以60,000个／孔铺96孔板，加入系列浓度的rhEPO，作用4h，检测萤光素酶活性。该方法操作简单，反应灵敏，变异性小，对于rhEPO的质量控制和临床应用具有重要意义。

主权项

一种应用转基因细胞株来检测重组人促红细胞生成素(rhEPO)生物活性的非诊断目的的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)构建报告基因质粒：将DNA反应元件SIE(Sis inducible element，SIE)，GRR(the gamma responseregion，GRR)和GAS(the interferon γ‑activated sequence，GAS)序列串联后重复三次得到复合反应元件R‑G序列；将R‑G序列插入pGL4.26载体多克隆位点，构建报告基因质粒，记为R‑G质粒；R‑G序列的正链为：5’‑GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAACGTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAACGTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC‑3'(2)根据rhEPO及其受体的作用机制，构建rhEPO反应性转基因细胞株：选用UT‑7细胞，用R‑G质粒转染UT‑7细胞，通过500μg/ml潮霉素加压筛选，进行单克隆细胞株分离培养，获得稳定细胞株UT‑7/G7，并用于rhEPO活性检测；(3)通过检测rhEPO刺激下荧光素酶含量的变化对rhEPO活性进行定量：(i)检测用分析培养基为500ml无酚红RPMI‑1640+5ml胎牛血清+6ml HEPES，检测用细胞培养板为白色底部透光96孔板；(ii)UT‑7/G7细胞用分析培养基培养17‑20h，离心收集后用分析培养基调整至1.2×10⁶个/ml，将50μl细胞悬液与50μl rhEPO系列稀释液同时加入96孔板，培养4h；(iii)加入100μl/孔荧光素酶底物，检测萤光素酶表达量；(4)利用SoftMax Pro软件四参数方程对rhEPO活性进行定量分析。