转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法

摘要

本发明公开了一种转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，通过基因克隆的方法从丹参中克隆得到了645bp的SmMYB75基因，构建了SmMYB75基因原核表达和亚细胞定位的载体；构建了植物高效表达载体，遗传转化丹参叶片获得了SmMYB75基因过表达的丹参毛状根，并通过一系列的生物技术的手段筛选得到了丹酚酸含量明显提高的转SmMYB75基因的丹参毛状根。本发明的方法为生产具有重要临床需求的丹酚酸提供了一种新型优质原料，对缓解丹酚酸药源的紧缺性问题具有积极的促进意义和应用价值。

主权项

一种转SmMYB75基因提高丹参毛状根中丹酚酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用基因克隆的方法从丹参中克隆获得SmMYB75基因，所述SmMYB75基因序列如SEQ ID:1所示；(2)根据丹参SmMYB75基因序列，把SmMYB75基因可操作性地构建于原核表达的载体，在大肠杆菌中进行表达；(3)定量PCR测定并分析SmMYB75在丹参的不同组织中的表达量及其对甲基茉莉酸调控的诱导表达量；(4)将SmMYB75基因构建于亚细胞定位的载体，转化根瘤农杆菌，进行烟草叶片的瞬时转化，对SmMYB75进行亚细胞定位分析；(5)把SmMYB75基因可操作性地构建于表达调控序列，形成含SmMYB75基因的植物表达载体；(6)将步骤(5)所得的含SmMYB75基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的含SmMYB75基因植物表达载体的发根农杆菌菌株；(7)利用步骤(6)所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参叶片，获得经PCR检测为阳性的丹参转基因毛状根克隆；(8)定量PCR测定步骤(7)获得的丹参转基因毛状根中的SmMYB75基因及丹酚酸生物合成途径中关键酶基因的相对表达量，并筛选出过表达SmMYB75基因的根系中基因表达量提高的根系；(9)高效液相色谱法测定步骤(8)中丹参转SmMYB75基因毛状根中丹酚酸的含量，筛选丹酚酸含量显著提高的转基因丹参毛状根根系。