基于CRICPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法

摘要

本发明公开了一种基于CRICPR-Cas9体外改造腺病毒载体的方法。本发明还提供了适于改造大质粒载体的分子克隆方法，包括如下：根据出发质粒的待改造位点设计合适的sgRNA，采用Cas9蛋白和sgRNA体外切割所述出发质粒，再基于同源重组的方法将被切割的出发质粒与目的基因相连接，从而完成改造。本发明所提供的方法有效的解决了大质粒载体用常规的分子生物学手段很难找到合适的限制性酶切位点对其进行改造的问题。该方法是点突变试剂盒的改进，点突变试剂盒一般就包括对目的蛋白进行点突变、构建结构域缺失的截短体等，本发明有效解决了点突变试剂盒对超过10kb的大载体进行突变时容易引起二次突变(由于PCR酶保真性引起的随机突变)的技术难点。

主权项

分子克隆方法，为将出发质粒的靶标基因替换为目的基因得到重组环形质粒，其特征在于：所述方法为包括如下步骤：(a)以所述出发质粒上所述靶标基因的起始区域中符合5’‑N_X‑NGG‑3’或5’‑CCN‑N_X‑3’序列排列规则的序列中的“N_X”所示序列为靶序列1；以所述出发质粒上所述靶标基因的终止区域中符合5’‑N_X‑NGG‑3’或5’‑CCN‑N_X‑3’序列排列规则的序列中的“N_X”所示序列为靶序列2；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸；针对所述靶序列1设计合成双链DNA1，所述双链DNA1中的一条链与所述靶序列1反向互补；针对所述靶序列2设计合成双链DNA2，所述双链DNA2中的一条链与所述靶序列2反向互补；(b)将所述双链DNA1和所述双链DNA2分别构建至能够转录向导RNA的载体中，经体外转录获得特异于所述靶序列1的向导RNA1和特异于所述靶序列2的向导RNA2；(c)采用Cas9蛋白、所述向导RNA1和所述向导RNA2切割所述出发质粒，获得切除了所述靶标基因的所述出发质粒的骨架片段；(d)根据所述目的基因的上下游末端部分的序列，以及所述出发质粒的骨架片段的上下游末端部分的序列，设计并合成自5’端到3’端依次为上游同源臂、所述目的基因、下游同源臂的DNA片段；所述上游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的3’端序列相同；所述下游同源臂的序列与所述出发质粒的骨架片段的5’端序列相同；(e)将步骤(d)获得的两端分别带有所述上游同源臂和所述下游同源臂的DNA片段与所述出发质粒的骨架片段进行同源重组，完成所述目的基因与所述出发质粒的骨架片段的连接，即获得将所述出发质粒的所述靶标基因替换为所述目的基因的重组环形质粒。