一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法

摘要

本发明涉及一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法，将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体；通过PCR扩增，扩增出sgRNA₂的表达框，然后通过无缝克隆在第一个sgRNA₁表达载体上的EcoR I位点实现第二个sgRNA₂表达框的插入，得到同时表达2个sgRNA的载体；然后通过PCR扩增，扩增出sgRNA₃的表达框，然后通过无缝克隆在42230-sgRNA₁₊₂上的EcoR I位点实现第三个sgRNA₃表达框的插入，得到同时表达3个sgRNA的载体，依次操作，即得。本发明可以同时实现基因家族成员的同时敲除，解决了现有方法的不足。

主权项

一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法，包括：(1)将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体，得到n个sgRNA表达载体42230‑sgRNA_n；其中n＝1、2、3、4…的正整数；(2)以Multi‑sgRNA F1、Multi‑sgRNA R为引物，通过PCR扩增，从第二个sgRNA表达载体42230‑sgRNA₂上扩增出sgRNA₂的表达框，然后通过无缝克隆在第一个sgRNA₁表达载体42230‑sgRNA₁上的EcoR I位点实现第二个sgRNA₂表达框的插入，得到重组载体42230‑sgRNA₁₊₂；(3)以Multi‑sgRNA F2、Multi‑sgRNA R为引物，然后通过PCR扩增，从第三个sgRNA表达载体42230‑sgRNA₃上扩增出sgRNA₃的表达框，然后通过无缝克隆在42230‑sgRNA₁₊₂上的EcoR I位点实现第三个sgRNA₃表达框的插入，得到重组载体42230‑sgRNA₁₊₂₊₃，然后使用同一对引物将扩增到的sgRNA₄的表达框通过无缝克隆在EcoR I位点实现第四个sgRNA₄表达框的插入，依次操作，即得同时表达多个sgRNA的载体42230‑sgRNA_{1+2+3.。。+n}。