禽网状内皮组织增生病病毒快速检测试纸条

摘要

本发明公开一种快速检测禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，纤维素膜层上标记有羊抗小鼠IgG的对照印迹，以及含有抗REV抗体的检测印迹；抗REV抗体为抗REV的单克隆抗体或多克隆抗体；金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗REV的多克隆抗体或单克隆抗体。该试纸条检测的特异性强、敏感性高，操作简便、快速，结果显示直观、准确，无需附加设备和试剂，检测成本较低，适合禽网状内皮组织增生病病毒的快速检测；使用范围广，便于推广应用。

主权项

一种快速检测禽网状内皮组织增生病病毒REV的试纸条，包括不吸水的支撑层、附着在支撑层上的吸附层，所述吸附层由样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层及吸水层依次拼接而成，其特征在于：所述纤维素膜层上标记有羊抗小鼠IgG的对照印迹；以及含有抗REV抗体的检测印迹；所述抗REV抗体为抗REV的单克隆抗体；所述金标抗体纤维层上附着有与检测印迹对应的以胶体金标记的抗REV的单克隆抗体；所述胶体金标记的抗REV的单克隆抗体是通过以下方法制备的：筛选抗REV的单克隆抗体细胞株，扩大培养后用PBS洗涤后1000 r/min离心10 min收集细胞，以1×10⁶～2×10⁶个细胞/鼠的细胞量腹腔注射经产母鼠，10～20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min离心10 min后取上清，获得单克隆抗体腹水；以柠檬酸钠还原法制备金溶胶：在50～100 mL沸腾的重量比为0.01%～0.05% 氯金酸水溶液中加入2～4 mL重量比为0.5%～2%的柠檬酸三钠溶液，反应后获得直径为15～20 nm的胶体金溶胶；以0.1 mol/L的K₂CO₃ 调节胶体金溶胶的pH值至8.5～9.5，以1:1000～1:1300的印迹比将所述的单克隆抗体腹水加入胶体金溶胶中，印迹10 min后，加重量比为20%的PEG‑10000至PEG‑10000的终重量浓度为0.05%，4℃、1500～3000 r/min离心20 min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000 r/min离心1 h，弃上清液，获得初步纯化的金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S‑400柱层析，分离纯化金标蛋白，得到胶体金印迹的抗REV单克隆抗体；所述抗REV的单克隆抗体细胞株是由以下方法建立的：将原核表达REV囊膜糖蛋白gp90的载体重组质粒PET‑28a‑gp90转化大肠杆菌BL‑21，挑选阳性单克隆菌培养，经IPTG诱导表达和培养，将超声波裂解后的上清液过镍柱纯化，得到纯化的REV gp90表达蛋白；将纯化的REV gp90表达蛋白以20～30 μg/只的剂量用福氏佐剂乳化制备免疫原，免疫6周龄Balb/c系小鼠三次，每次间隔15～30 d；最后一次加强免疫3～4 d后，将免疫小鼠眼球放血，拉颈处死，于体积比75%的酒精溶液中浸泡5～10 min，无菌取其脾细胞，剪碎并经100目尼龙网过滤，用GNK 洗液混悬脾细胞，1000 r/min离心10 min，收集脾细胞；将1×10⁸个脾细胞与2×10⁷～5×10⁷个NS0骨髓瘤细胞混合，再用GNK 洗液混悬后，1000 r/min离心10 min，弃上清，将细胞沉淀于37℃水浴中并在1 min内缓缓加入0.7～1.0 mL的pH8.5～pH9.0的PEG‑1500中，边加边轻轻摇晃，然后再缓慢加入GNK 洗液15 ml，37℃水浴5 min后补加GNK 洗液至总体积为40 mL，1000 r/min离心10 min，弃上清，将得到的细胞沉淀重悬于1640/HAT选择培养基中，以200 µL/孔铺板至96孔细胞培养板，置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养7～10 d，杂交瘤的培养上清用间接免疫荧光试验检测，挑选荧光较强的细胞克隆，用有限稀释法连续进行三次细胞亚克隆，最后筛选得到特异性的抗REV的单抗杂交瘤细胞株。