一种同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的PCR方法

摘要

本发明公开了一种非疾病诊断目的同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的PCR方法。针对四种粘孢子虫的18S rRNA、ITS1-5.8S-ITS2及28S rRNA基因，经过比对、分析与筛选，最终得到四对特异性引物；然后将四对引物放在一个PCR反应体系中，优化反应的退火温度、反应试剂及引物之间的平衡浓度，建立直接从样品中一次检测四种粘孢子虫的PCR方法。该方法既可以早期阶段检测粘孢子虫，还可以对粘孢子虫混合感染情况进行分析，具有较高的特异性与灵敏性，操作简便，快速准确。

主权项

一种非疾病诊断目的同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)DNA提取：剪取异育银鲫皮肤、鳃、咽及肝胰脏四个部位的部分组织，混合后置于研钵中，剪碎并加入液氮充分研磨，然后提取组织样品DNA；(2)特异性DNA片段扩增：分别以丑陋圆形碘泡虫的18S rRNA、吴李碘泡虫与洪湖碘泡虫的ITS1‑5.8S‑ITS2、武汉单极虫的28S rRNA基因为分子靶标，各设计一对特异性引物，分别命名为Mt18S F/R、MwITS F/R、MhITS F/R、Tw28S F/R；将四对引物置于单个PCR反应体系中，同时扩增四种粘孢子虫的特异性基因片段；(3)琼脂糖凝胶电泳检测，根据PCR扩增产物的片段大小进行结果判定，其中：扩增出894bp条带的是丑陋圆形碘泡虫，590bp的是吴李碘泡虫，447bp的是洪湖碘泡虫，245bp的是武汉单极虫，所述的四对特异性引物序列分别为：Mt18S F：5’‑ACCAGATATTTCGAGGAGTCGTTG‑3’Mt18S R：5’‑TTCCACAACGTTGCTATATAGCCA‑3’MwITS F：5’‑GCCGTACATGAATTGAGGCTTGAC‑3’MwITS R：5’‑TGCTCACAACGTTAACTCGAACC‑3’MhITS F：5’‑ACGACCAATATATGAAATTGTTTCTCGA‑3’MhITS R：5’‑TTCATTCGTAAAAATGACCTCTACTTTATAC‑3’Tw28S F：5’‑TTTGTAAAATTCTTAACGCTGGCTAA‑3’Tw28S R：5’‑TCGAAACGCCAAAACTACGTCA‑3’。