楸树内生真菌的原生质体的制备方法

摘要

本发明提供了一种楸树内生真菌的原生质体的制备方法；所述方法包括以下步骤：步骤1，菌丝体的制备；步骤2，原生质体的制备；步骤3，原生质体纯化；步骤4，原生质体再生。本发明所述方法制备的原生质体数量较多，可达到6×10⁷个/毫克菌丝，获得的原生质体的活力较高，再生率可达到1.2%。本发明选择培养12-24h的菌丝体，真菌处于快速生长期，生长快，细胞壁易于酶的裂解，释放出的原生质体的数量多，不易裂解，活力高。本发明选取5～30mg/ml Glucanex复合酶作为细胞壁裂解酶液，裂解效率高，原生质体释放数量多。本发明选用KCl或NaCl作为渗透压稳定剂，保证了原生质体制备数量与原生质体的稳定。

主权项

一种楸树内生真菌的原生质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1，菌丝体的制备；步骤2，原生质体的制备；步骤3，原生质体纯化；步骤4，原生质体再生；所述菌丝体制备具体为：取置于‑80℃保存的真菌孢子，于室温下解冻，在无菌操作台中吸取200μl，加入装有100ml液体PDA培养基的250ml锥形瓶里，放在摇床上，23～28℃摇晃培养，培养菌丝发酵，用400目无菌金属过滤筛收集菌丝，放入菌丝清洗液中清洗2次，用无菌吸水纸吸干水分；所述菌丝发酵培养条件：在温度为23～28℃，摇床的转速为100rpm，摇晃培养时间为12～24h；所述原生质体制备具体为：Glucanex酶用渗透压稳定剂配制为5～30mg/ml的酶液，充分溶解进行酶解，用无菌过滤膜过滤除菌备用；所述原生质体再生具体为：先在培养皿内铺一层原生质体固体再生培养基，冷凝后备用，制备PDA半固体再生培养基，置于室温下冷却至40℃，吸取10ml培养基加入100μL原生质体悬液，混匀，直接倒在培养皿的原有的固体再生培养基上，使之铺满平皿形成一固体薄层，待培养基凝固后置于28℃培养箱中培养2～3d，即可见再生菌落；所述原生质体固体再生培养基为：加入0.004％的去氧胆酸钠、1mol/L甘露醇、15g/L琼脂的PDA固体培养基；所述原生质体纯化具体为：菌丝酶解后用4层无菌擦镜纸过滤去除菌丝，将滤液收集到离心管中，4000rpm离心10min，弃去上清液，加入原生质体STC保存液重悬原生质体保存。