脂肪干细胞的制备及应用

摘要

本发明属于一种药物制备以及用途领域，具体涉及自体脂肪干细胞的制备以及治疗II型糖尿病用途。本发明的制备由抽脂、分离、培养三个主要步骤：在选定患者的抽脂部位后由手术医师进行一定量的脂肪无菌抽吸、对抽吸后的脂肪通过一系列洗涤，离心、消化后获得脂肪干细胞、最后将细胞放入培养设备中进行培养扩增。脂肪干细胞不仅能促进受损的胰岛组织修复，而且能调节免疫平衡，避免免疫损伤。

主权项

一种脂肪干细胞的制备方法，其特征在于：(1)脂肪干细胞分离：去除抽取的人体脂肪组织的下层血性肿胀液，将脂肪以500G离心3‑5分钟，去除离心后脂肪上层油脂和底层血性液体，获取中层纯脂肪，按体积比1:1加入0.1％胶原酶溶液充分混匀后放入37℃摇床，并以200rpm消化30‑40分钟，消化结束后再以800G离心5‑10分钟后获得干细胞沉淀，加入对应的患者血清10ml，充分混匀后加入以干细胞沉淀和生理盐水的体积比1:5加入生理盐水，再以300G离心3‑5分钟，离心后去除上层溶液，剩余底部沉淀，以体积比1:7加入生理盐水，再以300G离心3‑5分钟，重复3遍后，将最后得到沉淀通过100μm滤器过滤，得到的滤液为脂肪干细胞溶液。(2)脂肪干细胞培养：将脂肪干细胞加入由10％胎牛血清、1％青霉素及1％链霉素原液构成的高糖DMEM培养基重悬，并用100目滤网过滤，将细胞悬液接种于培养瓶中，在37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱中培养。48小时后换液，去除未贴壁细胞，此后每72小时换液1次，至细胞融合至80％后弃去原培养液，PBS洗涤1次，加入适量0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA进行消化3‑5分钟，加入高糖DMEM培养基终止消化，以800r/min离心5分钟，用含10％胎牛血清、1％青霉素及1％链霉素原液构成的高糖DMEM培养基重悬沉积细胞，按1:2的比例进行传代，当传代细胞生长接近单层融合70％时，可继续传代，传至第三代终止。