红托鹅膏菌丝体固液交替培养的方法

摘要

本发明涉及一种红托鹅膏菌丝体固液交替培养的方法，属于大型真菌培养技术领域。其特征为：将已经诱导并扩繁的菌丝体，采用固液交替培养方法，即固体培养4～6代后，液体培养3～4代，再进行固体培养，菌丝体的生长速度为未经液体培养前的8～10倍，生长明显加快。本发明通过简单改变培养方式，即加快了菌丝体的繁殖速度，其操作简单易实现、效益明显、生产成本低。鹅膏属毒素在开发新特效药如抗肿瘤、抗菌抗病毒、镇静或麻醉药等领域具有潜在地应用，但至今因其资源珍稀、难以人工驯化等瓶颈问题尚难以开发应用。本发明针对红托鹅膏菌丝生长非常缓慢等制约纯培养的问题进行了重点研究，为菌丝规模化培养及今后人工驯化栽培等提供了条件。

主权项

一种红托鹅膏菌丝体固液交替培养的方法，其特征为，采用固体—液体—固体的交替培养方法，即先固体培养3～6代，后液体培养3～4代，再进行固体培养2～3代，采用此种模式培养，可使红托鹅膏菌丝的生长速度为未经液体培养前的8～10倍，生长明显加快，其步骤为：先进行菌丝体的诱导及扩繁，然后固体培养，液体培养，再固体培养，具体如下：（1）红托鹅膏菌丝体的诱导及扩繁：野外采摘生长健壮、未开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.3cm²大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述的培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖13～15g/L、酵母膏1.20～1.40g/L、MgSO₄1.00g/L、CaCl₂ 1.00g /L、KH₂PO₄ 0.50g/L、16.0波美的麦芽汁120～140ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.8～6.0，在22～23℃下暗培养46～55天，组织块表面长出绒毛状白色菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代扩繁2～3次；（2）固体培养：将菌丝体转入含固体培养基的直径为9cm培养皿中，在22～23℃下暗培养70～80天，待菌丝长至3.5～4.5cm时，转接，培养3～6代；所述的固体培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖15～18g/L、酵母膏1.20～1.40g/L、ZnSO₄0.40～0.60 g/L、MgSO₄0.40～0.60g/L、玉米素ZT 1.00～1.20mg/L、复合生境物质90～100g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.8～6.0；所述复合生境物质的制备方法如下：在红托鹅膏生长地，取生长土、共生的滇青冈树根、滇青冈落叶，带回实验室，烘干，用高速粉碎机分别粉碎，按土：根：叶=1：1：1的比例混合；（3）液体培养：取培养皿中经固体培养3～6代的菌丝体，用直径为6mm的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，剔除上面的培养基，转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种4块，置于转速为150r/min、温度为25℃的摇床上培养，20天后，待菌丝长成分散的刺突状的细小菌球时，取10ml所培养的菌液移入新配的培养基中进行继代，20～25天，待小菌球逐渐变大，呈絮状的团块时，即可继代，3～4代后转回固体培养基中；其所述的液体培养基成分为：马铃薯200g/L、葡萄糖15～18g/L、酵母膏1.20～1.40g/L、ZnSO₄0.40～0.60g/L、MgSO₄0.40～0.60g/L、ZT1.00～1.20mg/L、复合生境物质水提液400～500ml，控制培养基PH值为5.8～6.0；复合生境物质水提液的制备方法如下：取以上复合生境物质200g，加入1000ml蒸馏水浸泡1天后，加热煮沸1～2hr，过滤，滤液加热浓缩成400～500ml；（4）固体培养：方法同步骤（2），培养2～3代。