一种没食子酸脱羧酶的分离纯化的方法

摘要

本发明公开了一种没食子酸脱羧酶的分离纯化方法。以没食子酸为底物，通过底物诱导产生没食子酸酸脱羧酶，再经过粗提、盐析、透析、DEAE纤维素柱和葡聚糖凝胶柱纯化分离，得到了没食子酸脱羧酶样品；再通过PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳初步测定其分子量、MALDI-TOF/TOF质谱鉴定对没食子酸脱羧酶的分子，本方法制备得到了没食子酸脱羧酶可降解没食子酸生产焦性没食子酸，与没食子酸为原料进行没食子酸脱羧酶方法比较，具有副产物少，污染小，对设备要求较低，生产工艺易实施，且制备得到的没食子酸脱羧酶纯度高，能够满足工业化生产的可能性。

主权项

没食子酸脱羧酶的分离纯化方法，其步骤如下：第一步，没食子酸脱羧酶(GAD)提取：将菌体细胞用含1～2mM二硫苏糖醇、50～100mM硫代硫酸钠的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)清洗2～3次，4～6℃下超声粉碎30～60min(超声5s、间隔5s)，4～6℃下离心15～30min(10000～20000r·min^‑1)，即从10～20瓶的发酵液中提取得到50～200mL酶液，存于4～6℃下备用。第二步，没食子酸脱羧酶(GAD)的盐析：将固体硫酸铵盐加入到发酵液中，第一次沉淀时硫酸铵盐浓度为60％，第二次沉淀时硫酸铵盐浓度为70％，两次沉淀才能够尽量的将蛋白质沉淀下来，20～30h为最佳盐析蛋白质的静置时间，最佳盐析pH值为6～7。第三步，没食子酸脱羧酶(GAD)的透析：硫酸铵盐提的蛋白质分子量主要分布在50～100kD范围内，其中70～90kD的蛋白质含量最高，因此，加去离子水使蛋白质分子脱离到溶液中，采用80kD的透析膜过滤，可以截留住大分子，去除小分子的杂质，以500～1000mL料液为基准，处理的最佳时间12～16h。第四步，没食子酸脱羧酶(GAD)的PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳初步测定其分子量：将菌体细胞破碎后的溶液同时利用电泳检测，在利用PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳初步测定GAD分子量时，15～20％的分离胶的分离效果比较好，因为这个浓度的分离胶蛋白分子拖尾现象得到了改善，整个胶体背景也较为清晰，比对标准品，蛋白质分子量大小在50kD以上。第五步，没食子酸脱羧酶(GAD)的DEAE纤维素柱的初步纯化：首先用pH值为7～10的磷酸盐缓冲液淋洗至接出液的pH值达到一个较为稳定，然后用0.4～0.8mol·L^‑1pH值为5～9的NaCl溶液洗脱(2mL·min^‑1速率)，每次收集5～10mL，检测280nm下吸收度，并绘制洗脱曲线。第六步，没食子酸脱羧酶(GAD)的葡聚糖凝胶柱纯化：上样上述洗脱液(50～100mL)，去离子水洗脱(速率1mL·min^‑1)，每5～10mL收集一次，以280nm的吸收度值作出洗脱条件下的曲线。第七步，没食子酸脱羧酶(GAD)的MALDI‑TOF/TOF质谱鉴定：应用MALDI‑TOF‑TOF‑MS对GAD蛋白条带belt1进行肽段测序，发现该蛋白条带共100～200条肽段，对其中离子强度较大的肽段采用MS/MS进一步的分析，对比BLAST，将这些肽段序列在NCBI数据库中分析同源性蛋白质，匹配到蛋白质。第八步，没食子酸脱羧酶(GAD)的酶学：酶活测定方法具体如下：即将粗酶液加入到含有没食子酸的试管中，反应一段时间后，终止反应，然后HPLC法测其中焦性没食子酸的含量。其中，终止剂为1～5％的香兰素溶于50～80％的硫酸溶液，以每20～40min生成1μmol的焦性没食子酸为一个酶活力单位，计算GAD的活力。