一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法

摘要

本发明公开了一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，包括如下步骤：（1）确定目标植物种类和目标基因，提取目标植物的总RNA，反转录为cDNA作为PCR的为模板，选择多个内参基因，设计特异性引物进行实时荧光定量PCR反应得到CT值；（2）将所述CT值数据通过geNorm、NormFinder、BestKeeper三种软件分析其适用性，用R软件的RankAggreg程序包，将每个处理里得到的四组适用性排序数据进行加权平均聚合，得到所述多个基因的最终适用性排序。本发明所述方法对于推动揭示植物生长发育、抗逆机理等基础性研究和培育速生、抗逆、丰产的植物新品种等应用型研究具有十分重要的意义。

主权项

一种快速鉴定和评价植物内参基因适用性的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)对胡杨进行前处理，用CTAB法氯仿抽提提取胡杨叶片的总RNA，从拟南芥、水稻研究中找到常用来作为内参基因的基因，以及已有的胡杨的转录组数据中，共挑出16个候选的内参基因，分别为18S、60S、Actin、Cpn60β、EF1α、eIF‑5A、GAPDH、GIIα、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB和UBQ，以及三个用于检测内参基因适用性的三个目标基因PePYL1、PeSCOF‑1和PeSCL7，对每个所述目标基因用Primer6软件设计特异性引物，对16个候选内参基因进行实时荧光定量分析，20ul的反应体系含有10ul SuperReal PreMix Plus，1ul的sscDNA，对应9ng的RNA，2ul的ROX reference Dye，上下游各0.3uM的引物，反应条件为95℃5min，95℃15s 60℃60s共40个循环，然后温度由40℃到100℃升温，每个温度下记录荧光值来获得溶解曲线，其中重复数为3，得到CT值；(2)先将CT值的平均值对数转换后输入geNorm软件，通过M值的大小对16个基因的稳定性进行排序，将对数转换未经过平均的三组CT值输入NormFinder分析stab值，并根据stab值的由小到大对16个基因的稳定性进行1‑16的排序，BestKeeper通过CV值得出稳定性排名并通过r²算出关联性排名，将得到的四组排名用R软件的RankAggreg程序包进行加权平均聚合，得到16个基因的最终稳定性排序，其中需要使用的内参基因的数目由geNorm软件算出的PV值进行确定。