一种水稻真空渗透遗传转化方法

摘要

一种水稻真空渗透遗传转化方法，该方法用一种水稻真空渗透遗传转化装置进行。该装置在支承桌中部设通孔，桌上放置底板，转化室放于底板上，底板上下表面中部设上、下圆柱，上、下圆柱上分别套有磁铁环Ⅱ和Ⅰ，下圆柱和磁铁环Ⅰ位于桌面之下，上圆柱和磁铁环Ⅱ位于室内，放置渗透液盛放容器的支架置于磁铁环Ⅱ上，室内上部内壁设环状承接台及带阀门的空气通气管、真空抽气接管，室的底端口和顶端口均设密封圈。该装置可以在转化室处于真空状态后，再通过磁铁环Ⅰ调控容器使渗透液与待转化植株稻穗接触进行真空状态下的目的基因的渗透转化。本发明方法操作简便、快速、能真正在真空状态下实现水稻原位渗透遗传转化，增强了农杆菌对植株的侵染力。

主权项

一种水稻真空渗透遗传转化方法，该方法用一种水稻真空渗透转化装置对水稻进行真空渗透遗传转化，包括以下步骤：A. 培养待转化的水稻受体植株：根据遗传转化计划，提前在温室内将待转化水稻植株种植在培养钵（20）内；B. 制备含目的基因的农杆菌渗透转化液：将构建好的Bar基因作为筛选标记的含目的基因的待转化载体用电击法转化到农杆菌LBA4404中；将保存的农杆菌菌液接种于含相应抗生素的YEP 液体培养基中，于 28℃、200r/min振荡培养至 OD600为0.7～0.9，离心收集菌体，菌体用渗透培养液重悬调节OD600至0.6‑0.8作为含目的基因的农杆菌渗透转化液备用，所述的渗透培养液为1/2MS液体培养基+ As 19.6mg/L + 200ul/L Silwet L‑77+蔗糖50g/L，pH5.8；C．真空渗透遗传转化：① 将固定连接有上圆柱（5）和下圆柱（2）的底板（4）放置在支承桌（1）上，使下圆柱（2）穿过支承桌（1）上的通孔（19）并位于支承桌（1）的桌面之下，将磁铁环Ⅱ（6）套在上圆柱（5）上；②将真空渗透遗传转化室（7）放置在底板（4）上表面，且使上圆柱（5）位于真空渗透遗传转化室（7）的室内，用密封圈Ⅱ将真空渗透遗传转化室（7）的底端口与底板的上表面密封连接；③从真空渗透遗传转化室（7）的顶端口将支架（8）的四条支腿（17）放置在磁铁环Ⅱ（6）的上表面上，在支架（8）的支承板（18）上放置盛有步骤B制备的含目的基因的农杆菌渗透转化液的渗透液盛放容器（9）；④当步骤A种植在培养钵里的水稻处于开花前时，将培养钵内的水沥干并用纱布或泡沫把培养钵内的土进行阻隔，然后连同水稻一起将培养钵倒置在真空渗透遗传转化室（7）的环状承接台（15）上，使活体水稻植株稻穗自然下垂，然后将盖板（12）盖在真空渗透遗传转化室（7）的顶端口并通过密封圈Ⅰ（13）将真空渗透遗传转化室（7）的顶端口与盖板（12）密封连接；⑤关闭空气通气管（10）上的阀门（11），将真空泵的真空管与真空渗透遗传转化室（7）壁上的真空抽气接管（14）连接，打开真空泵开关，减压抽真空, 维持0.05 MPa压力，保持真空渗透遗传转化室（7）为该真空状态，然后再将磁铁环Ⅰ（3）套在下圆柱（2）上且使磁铁环Ⅰ（3）与磁铁环Ⅱ（6）相邻的磁极为同极，手动向上推动下圆柱（2）上的磁铁环Ⅰ（3），当渗透液盛放容器（9）随之上升到使倒置的活体水稻稻穗完全浸泡在渗透液盛放容器（9）内的含目的基因的农杆菌渗透转化液中时，停止向上推磁铁环Ⅰ3，且手托住磁铁环Ⅰ（3）不动并维持磁铁环Ⅰ（3）处于使倒置的活体水稻稻穗完全浸泡在渗透液盛放容器9内的含目的基因的农杆菌渗透转化液中的位置，此时立即开始计时，当活体水稻植株在渗透液盛放容器9内浸泡达到预定渗透遗传转化时间后，取下磁铁环Ⅰ（3），磁铁环Ⅱ（6）随之向下滑落至底板（4）上，渗透液盛放容器（9）及支架（8）也随之向下降落，水稻植株与渗透液盛放容器9内的含目的基因的农杆菌渗透液分离，培养钵内水稻植株的渗透遗传转化即完成；此时关闭真空泵开关，然后缓慢打开阀门（11），待真空渗透遗传转化室（7）室内恢复常压状态后，打开盖板（12），再从真空渗透遗传转化室（7）的顶端口将培养钵（20）连同水稻一起取出；所述的一种水稻真空渗透遗传转化装置，其特征在于：该装置设有支承桌（1）、底板（4）、磁铁环Ⅰ（3）、磁铁环Ⅱ（6）、下圆柱（2）、上圆柱（5）、真空渗透遗传转化室（7）、支架（8）、渗透液盛放容器（9），密封圈Ⅰ（13），密封圈Ⅱ（16）部件，具体结构是：真空渗透遗传转化室（7）的结构：真空渗透遗传转化室（7）为中空的圆柱形，且真空渗透遗传转化室（7）的顶端和底端均为敞口，在真空渗透遗传转化室（7）的顶端口盖有盖板（12），真空渗透遗传转化室（7）室内上部的内壁固定连接有环状承接台（15），在位于环状承接台（15）之上的室壁上分别设置有空气通气管（10）和真空抽气接管（14），空气通气管（10）上设置有阀门（11）；支架（8）的结构：支架（8）由四条竖直的支腿（17）和支承板（18）组成，在四条竖直的支腿（17）的顶端分别与支承板（18）的下表面固定连接；总体结构：在支承桌（1）的桌面中部设置有通孔（19），支承桌（1）的桌面上放置有底板（4），底板（4）的下表面中部垂直固定连接有下圆柱（2），下圆柱（2）上间隙套有磁铁环Ⅰ（3），通孔（19）的直径D大于磁铁环Ⅰ（3）的外径K，D＞K，下圆柱（2）和磁铁环Ⅰ（3）均穿过通孔（19）位于支承桌（1）桌面之下，在底板（4）上表面中部且在与下圆柱（2）对应的位置垂直固定连接有上圆柱（5），上圆柱（5）上间隙套有磁铁环Ⅱ（6），磁铁环Ⅰ（3）与磁铁环Ⅱ（6）相邻的磁极为同极；真空渗透遗传转化室（7）放置在底板（4）的上表面中部，且上圆柱（5）及其套有磁铁环Ⅱ（6）位于真空渗透遗传转化室（7）的室内；支架（8）的四条支腿（17）放置在磁铁环Ⅱ（6）的上表面上，在支架（8）的支承板（18）上放置有渗透液盛放容器（9），渗透液盛放容器（9）位于真空渗透遗传转化室（7）室内的环状承接台（15）的下方；支腿（17）的长度H与磁铁环Ⅱ（6）的厚度N之和大于上圆柱（5）的柱高L，H+N＞L；磁铁环Ⅱ（6）位于上圆柱（5）最低处时，渗透液盛放容器（9）口与环状承接台（15）下表面之间的距离R为80cm～120cm；真空渗透遗传转化室（7）的底端口通过密封圈Ⅱ（16）与底板（4）的上表面密封连接，真空渗透遗传转化室（7）的顶端口通过密封圈Ⅰ（13）与盖板（12）密封连接。