一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法

摘要

本发明公开了一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法。该方法包括九个步骤：(1)制备培养基；(2)制备发酵种子菌液；(3)扩大发酵的条件；(4)抗生素ZwA的第一次纯化萃取法；(5)抗生素ZwA的第二次纯化大孔树脂法；(6)抗生素ZwA的第三次纯化硅胶层析法；(7)高效液相色谱法纯度检测；(8)质谱法分子量定性分析；(9)得到制备出包含分子量为364和382两种分子结构的水溶性抗生素的结论。本发明所制备的水溶性抗生素纯度高，与苏云金芽胞杆菌的Cryl A、Cry1 B、Cry1 C等晶体蛋白协同作用可以提高对农业害虫的生物杀虫效果；另外对大肠杆菌和引起小儿肺炎的金黄色葡萄球菌也有抑制效果。

主权项

一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法，其特征在于具体步骤为：(1)制备培养基1.1斜面培养基：牛肉膏3‑6g，蛋白胨5‑15g，氯化钠3‑7g，琼脂粉10‑20g，pH7.0‑7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用；1.2菌株HD‑1种子培养基：酵母膏3‑7g，蚕蛹蛋白膏5‑15 g，氯化钠5‑15 g，pH7.0‑7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用；1.3初始发酵培养基：葡萄糖10‑30g，蚕蛹蛋白膏10‑30g，CaCL₂ 0.05‑0.10g，K₂HPO₄ 1‑2g，MgSO₄ 0.1‑0.3g，MnSO₄ 0.05‑0.1g，pH 7.0‑7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用；1.4扩大生产发酵培养基：蚕蛹蛋白膏7‑11g，葡萄糖2‑5g，氯化钠 1‑4g，MgSO₄·7H₂O 0.2‑0.4g，K₂HPO₄ 0.2‑0.4g，MnSO₄ 0.02‑0.07g，pH7.5，定容至1L，121℃灭菌30min备用；1.5供试菌活化培养基：牛肉膏2‑8g，蛋白胨5‑15g，氯化钠2‑8g，pH 7.0‑7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用；1.6抑菌活性测定固体培养基：牛肉膏2‑8 g，蛋白胨5‑15 g，氯化钠5‑20 g，琼脂粉10‑20g，pH 7.0‑7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用；(2)制备发酵种子菌液首先，将保存于‑20℃冰箱的甘油保藏菌种HD‑1放到室温复苏，至完全解冻，将其接种到LB斜面培养基上，30℃过夜培养，取出后保存于4℃冰箱备用；然后，从保存好的HD‑1斜面培养基上取0.5㎝×1.0㎝大小的斜面培养物接种于300mL摇瓶中，内含有种子培养基100mL，置于220r/min摇床30℃培养10‑20 h；2.1菌株HD‑1发酵液的制备将活化好的HD‑1种子培养基以2%的接种量接种到灭过菌的初始发酵培养基中，培养基不超过容器体积的2/3，30℃摇瓶培养20‑40 h，然后，5000‑10000r/min离心5‑15min、收集上清，4℃冰箱保存，此过程有抗生素生物合成；2.2初次抑菌活性检测采用管碟法，以草生欧文氏杆菌为指示菌，检测浓缩10倍后的HD‑1发酵液上清液的抑菌活性，空白培养基作对照，将甘油保存的草生欧文氏杆菌菌种接种到活化培养基中，30℃摇瓶培养10‑15h，然后2%的接种量将菌液加入到冷却至45℃的抑菌活性测定固体培养基中，轻摇混匀，先在灭菌的玻璃培养皿内加注无菌固体培养基作为底层，冷却后摆放牛津环，再将混匀的加菌液的固体培养基轻轻加入到底层培养基上，双层培养基都要薄而均匀，静置冷却后，用灭过菌的镊子轻轻取下牛津环，在孔中加入待测液，液面和上层培养基面齐平，然后，在28℃恒温培养箱内培养10‑15h，测其抑菌圈直径大小，抑菌直径为抑菌圈外径减去牛津环外径，在做抑菌试验时，将上清液95℃水浴15min后，用1mol/L的NaOH调至中性或偏碱性，验证抗生素的存在，由于ZwA的浓度与抑菌圈直径存在线性关系，因此，将以抑菌圈的直径来间接表示ZwA浓度；(3)扩大发酵的条件3.1发酵培养基：采用18L发酵罐培养，罐内装培养基不能超过体积的2/3，以5‑15L为宜；3.2发酵时间：将活化好的摇瓶种子培养基接种到扩大生产发酵培养基中，培养20‑40h；3.3培养温度：将活化好的摇瓶种子培养基接种到扩大生产发酵培养基中，在20℃‑40℃恒温下培养；3.4培养基初始pH：将已接种的扩大生产发酵培养基，用1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH值5.0‑10.0；(4)抗生素ZwA的第一次纯化萃取法取10L发酵液分批次5000‑10000r/min离心，5‑20min，回收上清液，用1mol/L的HCl调至pH4.0，在50℃下真空浓缩，真空度‑0.095‑‑0.088Mpa，浓缩至200mL，加入100mL无水乙醇，轻轻摇匀，静置1小时后再次5000‑10000r/min离心5‑20min，取上清，上清液用等体积的石油醚萃取后，收集水相，至无醇味和石油醚味，加水补至原体积，即得ZwA粗提液，做抑菌试验验证ZwA的存在，之后保存于4℃冰箱备用；(5)抗生素ZwA的第二次纯化大孔树脂法根据ZwA的水溶性强、弱极性等特点，选用非极性大孔树脂LX‑68M、LX‑22、LX‑762及LXA‑8对ZwA进行初步纯化；5.1大孔树脂预处理：称取一定量的湿重树脂，使用前均做预处理，流程如下，首先，将称好的树脂装入玻璃层析柱中(60cm×2cm)，用2倍柱床体积的1mol/L的HCl溶液以1mL/min的流速对树脂层进行洗脱，并浸泡树脂4h，然后用去离子水以同样流速冲洗树脂，至流出水pH 呈中性；然后用2倍柱床体积的1mol/L的NaOH溶液以1mL/min的流速对树脂层进行洗脱，并浸泡树脂4 h，用去离子水以同样流速冲洗树脂，至流出水pH 呈中性；再用1倍柱床体积的乙醇浸泡树脂6h；用2倍柱床体积的乙醇以1mL/min 的流速通过树脂柱，再浸泡树脂4h；再用去离子水以同样流速洗至无乙醇味为止；5.2 ZwA的纯化：按树脂量与粗提液1:2(W/V)的比例，分别上样10mL，湿法装柱，室温静态吸附3h后，先用去离子水动态洗脱，洗脱体积初定4倍柱床体积，洗脱液为未吸附相，再用50%的乙醇洗脱4倍柱床体积，洗脱组分为A，再用无水乙醇洗脱4倍柱床体积，洗脱组分为B，洗脱时流速约0.5mL/min，分别收集洗脱液，减压浓缩后去离子水定容至10mL，对A和B分别做抑菌试验验证ZwA的存在，之后保存于4℃冰箱备用；(6)抗生素ZwA的第三次纯化硅胶层析法称取100‑140目硅胶150g，用无离子水浸泡3h，冲洗，抽干，再用浓盐酸洗涤以除去残留的杂质，然后用去离子水洗至中性，抽干，再用无水乙醇浸泡过夜，抽干，临用前120℃烘干至恒重，再用无离子水浸泡过夜即可装60cm×2cm层析柱；6.1装柱与ZwA的上样：采用湿法装柱，干法上柱；用无离子水将浸泡过夜的硅胶搅拌成匀浆，缓慢加入玻璃层析柱中，60cm×2cm层析柱，多余无离子水洗脱剂流出，上层加入4cm的石油醚，然后取5mL大孔树脂第二次纯化后的样品ZwA，加入适量干硅胶搅拌至干粉状，缓慢加入层析柱的上层石油醚液中，目的是使样品暂时与洗脱剂分开，避免洗脱剂夹带样品快速流下，装柱要确保层析柱均匀，实在、无气泡、无断层；柱床总高度约30‑50cm；6.2 ZwA的纯化：洗脱剂为乙酸乙酯:甲醇=70:30(V:V)，洗脱速度为0.5mL/min，用部分收集器分段收集，每管10mL，以紫外吸收法在线监测ZwA样品的紫外吸收出现，以2%茚三酮比色法在565nm波长下检测ZwA样品的颜色出现，直到无ZwA样品的紫外吸收出现、无ZwA样品的颜色出现时，终止洗脱，共收集30管，根据颜色一致性合并为10管，对各管溶液做抑菌试验验证ZwA的存在，之后保存于4℃冰箱备用；6.3 ZwA样品的冷冻干燥处理：使用冷冻干燥机对上述各管液体进行冷冻干燥处理，冷冻干燥至无水成为干粉，之后保存于4℃冰箱备用；6.4茚三酮比色反应6.4.1配置pH6.7的磷酸盐缓冲溶液：分别称取磷酸二氢钾4.5350g和磷酸氢二钠11.9380g于小烧杯中，用少量去离子水溶解后，移入500ml容量瓶中，再用去离子水定容至刻度，摇匀备用，取55. 0ml磷酸二氢钾溶液与45. 0ml磷酸氢二钠溶液混合摇匀，即得到pH6.7的磷酸盐缓冲溶液；6.4.2配置2%茚三酮显色液：分别称取2.0000g茚三酮和1.0000g氯化铬，加入乙二醇缓慢加热至完全溶解，转入100ml容量瓶中，再用磷酸盐缓冲溶液定容至刻度，摇匀，放置过夜，次日用，若有沉淀，过滤后使用；6.4.3显色反应：取各管洗脱液分别0.5mL，2%茚三酮0.5mL，磷酸盐缓冲溶液1mL，于10mL带刻度试管中，摇匀后沸水浴15min，冷却10min，用去离子水定容至10mL，摇匀，稳定15min后测量，以洗脱剂作空白对照，用紫外分光光度计先进行全190‑800nm波长扫描，确定其最大紫外吸收波长，然后测定各样品在最大吸收波长下的吸光度A，绘制洗脱曲线；(7)高效液相色谱法纯度检测：7.1检测样品制备：分别取6.3的干粉样品，分别用1毫升无离子水溶解，备用；7.2高效液相色谱法检测：将7.1的10个组分别做HPLC检测，用面积归一法分析其纯度；色谱条件：反相C₁₈分析柱，流动相为水:甲醇=85:15(V/V)，紫外检测器，检测波长210nm，流度0.5mL/min，进样量10μL，柱温35℃；7.3再次用抑菌活性法检测：采用管碟法，对7.1的10个组分进行抑菌活性检测，进一步确定纯化后ZwA的富集区段；(8)质谱法分子量定性：质谱检测：称取0.0100g，用质谱检测仪鉴定其分子量；质谱检测条件：电喷雾离子源即ESI，毛细管电压为3.5kV， 锥孔电压为150V，离子源温度为100℃，干燥气温度为300℃，脱溶剂气体流速500L/h，锥孔气体流速为50L/h，水作溶剂；(9)结论：由(8)质谱分析图确定，所制得的水溶性抗生素中含有364和382两种分子量的分子结构；所述分子量为364的水溶性抗生素的分子结构为：；所述分子量为382的水溶性抗生素的分子结构为：。