应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序实验方法

摘要

本发明涉及应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，首先斑马鱼胚胎样本进行甲醛交联，然后通过MNase酶切获取单核小体，H3抗体将染色质固定在磁珠上，从而在磁珠上对各种不同的样品加上不同的标签接头，再将染色质从磁珠上释放出来浓缩后将样品混合在一起进行各种抗体的染色质免疫共沉淀反应，获得DNA样品纯化后建库测序。本发明iChIP是在传统的ChiP上进行的改良，这种方法是通过在染色质免疫共沉淀前先将每个样本进行标记后再将所有样品混合在一起进行实验，能观察到在发育过程中染色质修饰的一个动态变化，减少早期细胞量少可能造成的实验偏差，且可以通过细胞数数量对整个发育过程中的染色质修饰动态变化进行定量观察。

主权项

应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP‑seq)实验方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)斑马鱼胚胎样本前处理：取200个胚胎于2ml离心管中，用预冷的PBS洗三次后加入1％甲醛1750ul摇床轻摇交联3min，加200ul 1.25M甘氨酸摇床轻摇5min终止交联；(2)斑马鱼胚胎细胞核裂解：经过前处理的斑马鱼胚胎样品再用PBS加蛋白抑制剂洗涤3次，最后一次尽量将液体吸干净。加入1ml预冷的裂解缓冲液(加蛋白抑制剂)，用1ml广口的移液器枪头冰上反复吹打胚胎，直至胚胎裂解，冰上放置3‑4min，直至裂解液变清，离心收集细胞核，用1mlPBS(加蛋白抑制剂)重悬细胞核于新的1.5ml的离心管中，离心去上清；(3)微球菌酶(MNase)酶切反应：用200ul酶切消化缓冲液(加蛋白抑制剂)重悬细胞核，25度预热2min，加稀释好的MNase于离心管中轻轻混匀，25度反应5‑10分钟；(4)终止反应及超声片段化DNA反应结束后立即加入200ul MNase终止缓冲液，轻轻混匀后，biorupt超声4*30sec，离心10min，取50ul上清加50ulGilchrist终止缓冲液，65度90分钟解交联，加1ml无水乙醇，40ul3M pH5.3NaAc，‑80度沉淀后Qiagen试剂盒纯化得input DNA；(5)透析及磁珠平衡：将剩下的上清液转至透析卡中，于透析缓冲液ChIP buffer中轻摇2h，4度。每个样品取15ul Dynabeads Protein G，用PBS加BSA5mg/ml洗涤平衡3次备用；(6)染色质固定：透析结束吸出透析卡中的染色质离心取上清，转至低吸附的离心管中，加入提前准备好的磁珠，加1.3ug H3抗体，4度轻摇孵育20h，然后用150ul 10mM Tris Cl(加蛋白抑制剂)洗涤3次，每次于4度轻摇5min；(7)染色质标记：20ul上述液体重悬磁珠，加25ul2*ER混合缓冲液，2ul T4PNK酶，2ul T4聚合酶，低吸附枪头混匀，于热循环仪器中12度25min，25度25min，4度；末端修复完成后用150ul Tris Cl(加蛋白抑制剂)洗涤一次，然后用上述液体42ul重悬磁珠，加5ul 10*NE缓冲液，2ul Klenow，1ul dATP，低吸附枪头混匀，37度反应30min，再次用150ul Tris Cl(加蛋白抑制剂)洗涤一次，用18ul上述液体重悬磁珠，加25ul2*快速连接缓冲液，5ul快速连接酶，5ul 0.75uM Y‑型indexed接头，低吸附枪头混匀，25度反应40min，再用150ul Tris Cl(加蛋白抑制剂)洗涤一次；(8)染色质释放及磁珠平衡：每个样品中加12.5ul 100mM DTT，振荡混匀，室温孵育5min，然后再加12.5ul染色质释放缓冲液(加蛋白抑制剂)，然后将所有样品混合在一起，37度孵育震荡30min，磁力架上取上清，转至30KD蛋白浓缩管中，用TE缓冲液补至体积为500ul，离心20min，然后将蛋白浓缩管倒放至新的离心管中收集浓缩后的染色质；每个样品取50ul Protein G磁珠，用PBS加5mg/ml BSA洗涤平衡三次备用；(9)染色质免疫共沉淀：将上述浓缩后的染色质转至低吸附离心管中，加440ul水，150mM NaCl，0.5％Tx‑100，加上述平衡后的磁珠，加组蛋白修饰抗体，4度孵育3h；(10)洗涤及iChIPed DNA洗脱用磁力架去除上清，用200ul预冷的RIPA缓冲液洗涤5次，RIPA缓冲液加350mM NaCl洗涤两次，LiCl缓冲液洗涤两次，TE缓冲液洗涤1次，以上洗涤每次8min；然后加50ul洗脱缓冲液加2ul RNase A，37度洗脱30分钟，转上清至新的离心管中加2.5ul蛋白酶K，65度解交联过夜，磁珠重复洗脱一次，体积共100ul；(11)纯化及建库测序解交联过夜DNA用AMPure磁珠纯化，24ul无核酶水洗脱；Qubit对iChIP下来的样品进行定量，然后加上下游引物及PCR混合液扩增建库，再用AMPure磁珠去除引物二聚体，bioanalyzer检查文库质量，Hiseq2500的125PE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。