一种皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法，本发明中P4代脐带间充质干细胞具有细胞数量多，表型稳定，且能分泌大量的混合细胞因子，能够满足大规模生产细胞损伤修复试剂的要求，从而实现将细胞损伤修复试剂应用于临床治疗皮肤损伤修复的目的。

主权项

一种皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法，其特征在于：由下列步骤组成：①取足月健康胎儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗‑HCV，HCV‑RNA,抗‑HDV，抗HEV，抗‑HIV‑1/2，HIV‑1‑RNA,CMV‑DNA，检测结果均为阴性的脐带方可使用；②将脐带从采集瓶中取出，置于无菌平皿中，用无菌手术剪剪成5cm左右的小段；③将脐带段浸没于无菌烧杯中，用PBS反复清洗残留在血管内的血液，直至清洗后的PBS基本无色为止；④将清洗后的脐带转移到弯盘中，使用手术剪或手术刀将其剪切成1‑5mm的小块，均匀平铺到T75培养瓶底部；⑤将平铺好脐带组织块的培养瓶放入二氧化碳培养箱内，干燥30分钟；⑥往培养瓶中缓慢加入含10％胎牛血清添加物的DMEM/F‑12培养基，培养基的用量以刚刚浸没组织块为宜；⑦每6天换液1次，期间观察组织贴块边缘细胞生长情况，待大多数组织块细胞爬出且每个块组织块周围的细胞生长至80％左右融合时，进行脐带间充质干细胞的原代传代；⑧将间充质干细胞细胞传至P4代时，按8000cells/cm²的密度接种于T75培养瓶中，加入10ml DF12完全培养基；⑨待细胞长至80％左右融合时，用5mL PBS缓冲液冲洗细胞表面3次；⑩吸尽PBS缓冲液，加入10mL DF12培养基继续培养72小时；收集培养72小时后的脐带间充质干细胞培养上清，将上清收集到50mL离心管内；300g，室温离心5分钟；弃沉淀，收集干细胞培养上清液，用3KD的超滤管对干细胞上清进行浓缩，浓缩10倍，获取含有3KD以上分子量的有效干细胞分泌混合因子；将浓缩后的干细胞分泌混合因子用0.22μm的滤膜进行过滤，置于无菌瓶中，‑20℃保存；在干细胞分泌混合因子添加5g海藻糖；在干细胞分泌混合因子添加1mg透明质酸，获得皮肤细胞损伤修复试剂。