利用SNP和SSR技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法及应用

摘要

本发明一种利用SNP芯片技术及SSR标记技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法及应用。以矮脚黄A不育系与贺B矮杂交获得F2代分离群体为研究对象，通过SNP芯片技术转化获得系列与育性连锁的可电泳检测的SNP标记，并由芯片SNP标记信息开发与育性基因连锁的SSR分子标记。获得的SSR分子标记可以快速鉴定出不育系转育后代群体内单株基因型，为不育系的快速选育及后期杂交制种提供便利，同时为不结球白菜隐性细胞核雄性不育相关基因的精细定位和克隆奠定基础。

主权项

一种利用SNP和SSR技术共同筛选不结球白菜隐性核不育系育性相关分子标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)对F2代分离群体中各单株编号挂牌，在F2群体内选取30个不育单株和30个可育单株，利用试剂盒分单株提取样品DNA，每10份单株样品DNA等量混合，分别混合得到三个不育集团池和三个可育集团池；2)将上述六个集团池DNA分别与芯片杂交，然后对芯片进行清洗、染色和扫描，收集扫描的SNP数据；3)将SNP数据进行数据分析，三个不育集团池与三个可育集团池芯片数据分析评估后共获得73个SNP差异位点，将获得的SNP差异位点序列提交白菜基因组数据库比对分析后显示，上述差异位点分布于白菜A2连锁群的共计56个，A5、A3、A9、A8连锁群各一个；其中，基因分型后，不育材料基因型为“AA/BB”对可育材料基因型“AB”为差异，或不育材料缺失“NC”对可育材料“AA/BB”为差异，共计四种差异类型；4)根据上述分布于A2连锁群上的SNP差异位点序列为模板设计17对AS‑PCR引物；5)以三个可育集团池和三个不育集团池为模板，用17对AS‑PCR引物分别进行PCR，共获得6个差异标记，分别命名为LX4、LX5、LX7、LX8、LX11、LX12‑1；6)将上述获得的6个差异标记序列与白菜基因组A2连锁群进行比对，获得的相应区段作为候选区段；每个标记序列上下游各选取约10K长度的序列，作为引物设计提交序列；设计64对SSR引物；以三个可育集团池和三个不育集团池为模板，用64对SSR引物分别进行PCR，6％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，共获得10个差异标记，分别命名为：SSR 4‑1，SSR 60‑1，SSR 60‑2，SSR 60‑5，SSR 7‑1，SSR8‑2，SSR 8‑3，SSR 810‑6，SSR 810‑12；7)将上述标记进行F2代2623个单株的分离大群体验证：a.利用可育和不育表型差异，在2623个单组成的F2代分离群体中，花期表型鉴定挑选出632株不育单株，提取单株DNA，利用SSR4‑1，SSR 60‑1，SSR 60‑2，SSR 60‑5，SSR 7‑1，SSR 8‑2，SSR 8‑3，SSR 810‑6，SSR 810‑8，SSR810‑12标记进行单株PCR扩增大群体检测；b.基于孟德尔和摩尔根遗传连锁和分离规律，将上述10个SSR分子标记F2代群体单株基因型数据以及单株育性性状统计数据，运行MAPMAKER/EXP Version 3.0软件分析，确定其遗传距离；结果表明:SSR60‑1，SSR60‑2，SSR8‑2与目标基因遗传距离<1cM，分别为0.79cM、0.94cM、0.63cM。