一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法

摘要

本发明公开了一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法。所述CTL制备方法，包括以下步骤：（a）免疫磁珠阴性分选去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞；（b）将混合细胞置于装有无血清培养基中培养，获得悬浮细胞和贴壁细胞，（c）贴壁细胞中加入GM-CSF及IL-4，培养5天；第6天，加入肿瘤细胞全抗原，第7天加入TNF-α和IL-27；（d）将悬浮细胞移至经抗CD3单抗和重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，加入IFN-γ，第2天加入IL-2、IL-12、IL-27，培养至第8天，得到CIK细胞；（e）将CIK细胞与成熟DC细胞混合，加入IL-12、IL-7、抗CD28单克隆抗体培养；第3天，加入抗CTLA-4单克隆抗体，再培养4天。本发明所述方法提高体外CTL细胞增殖的效率及其靶向杀伤肿瘤细胞的活性，抑制外周血单个核细胞向CD4⁺CD25⁺Treg细胞转化。

主权项

一种高效增殖、靶向杀伤肿瘤的CTL制备方法，包括以下步骤：（a）去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞：采集并分离外周血单个核细胞，通过免疫磁珠阴性分选法去除CD4⁺CD25⁺Treg细胞，得到CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺以及CD14⁺的混合细胞；（b）分离T淋巴细胞和DC细胞：将得到的混合细胞置于无血清培养基中，在37℃、5%CO₂的培养箱中静置孵育，获得T淋巴细胞和DC细胞，（c）成熟DC细胞的制备：将T淋巴细胞转移至新的培养瓶中；贴壁的DC细胞中加入含有50ng/mL GM‑CSF及25ng/mL IL‑4的无血清培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中扩增培养5天；第6天，加入肿瘤细胞全抗原，第7天得到负载肿瘤细胞全抗原的DC细胞，并在培养基中加入30ng/mL TNF‑α和10‑30ng/mL IL‑27，得到成熟的DC细胞；（d）CIK的制备：将T淋巴细胞转移至经50ng/mL抗CD3单克隆抗体和1μg/mL重组人纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并在无血清培养基中加入1000U/mL IFN‑γ，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；第2天在培养基中加入20ng/mL IL‑2、5‑15ng/mL IL‑12、5‑20ng/mL IL‑27，培养至第8天，得到CIK细胞；（e）CTL细胞的制备：将上述（d）步骤得到的CIK细胞与（c）步骤得到的成熟DC细胞，在含有5ng/mL IL‑12、5‑15ng/mL IL‑7、50ng/mL抗CD28单克隆抗体的无血清培养基中混合培养，且所述CIK细胞和所述成熟DC细胞的混合比例为10：1；混合培养的第3天，在培养基中加入50ng/mL‑1μg/mL抗CTLA‑4单克隆抗体，继续培养4天即可得到CTL细胞。