含N-非取代葡萄糖胺肝素六糖的制备及其纯化

摘要

本发明涉及一种含N-非取代葡萄糖胺(GlcNH₃⁺)肝素六糖的制备及其纯化。所述方法是以酶解低分子量肝素为原料，通过凝胶色谱和离子交换高效液相色谱等方法分离提纯肝素钠六糖；利用阳离子交换树脂和吡啶中和法制备肝素吡啶六糖；最后用脱N-硫酸化法制备含不同GlcNH₃⁺数目的肝素六糖，并用SAX-HPLC等方法进行分离提纯。本方法可特异性制备出含不同GlcNH₃⁺数目和序列的系列肝素寡糖，为硫酸类肝素中GlcNH₃⁺残基的结构与功能及其与疾病关系的研究提供重要的糖库。

主权项

一种含N‑非取代葡萄糖胺的肝素六糖的制备及其纯化方法，其特征在于：具体步骤如下：1) 肝素钠六糖的制备与提纯：采用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ于37℃酶解分子量为3‑8kD的低分子量肝素，然后将所得酶解低分子量肝素经过聚丙烯酰胺凝胶色谱柱，以0.2M NH₄HCO₃为流动相，并在UV232nm下测量洗脱液的吸光度；收集肝素钠六糖混合物的洗脱峰，经50‑60℃水浴去除NH₄HCO₃，真空冷冻干燥后得到肝素钠六糖混合物；利用SAX‑HPLC，在0‑0.6M NaCl,0.6‑1.3M NaCl条件下进行两相线性梯度洗脱，分离收集高度硫酸化的肝素钠六糖粗品；把收集到的肝素钠六糖粗品在超纯水中透析3天后，冷冻干燥；2) 肝素吡啶六糖的制备：在4℃下，把步骤1）经过透析并冷冻干燥中获得的肝素钠六糖经过 H型阳离子交换树脂，去除糖链上的钠离子，所得的洗脱液在室温下用吡啶中和至pH为6‑6.5；把中和后的洗脱液冷冻干燥，得到肝素吡啶六糖干品；3) 含GlcNH₃⁺肝素寡糖的制备和纯化：把步骤2）中获得的肝素吡啶六糖干品溶于DMSO：H₂O（v/v）=95：5溶剂中，经30℃水浴20min，选择性地脱除肝素链N位上的硫酸根；透析冷冻干燥后，用SAX‑HPLC，在0‑0.6M NaCl,0.6‑1.3M NaCl条件下进行线性梯度洗脱，分离收集含不同GlcNH₃⁺数目的肝素六糖；把收集到的含不同GlcNH₃⁺数目的肝素六糖，分别透析并冷冻干燥，得到纯化的含一个、两个和三个GlcNH₃⁺的三种肝素六糖。