基于硫代修饰的碘酒裂解型基因克隆方法

摘要

本发明公开了一种基于硫代修饰的碘酒裂解型基因克隆方法。其扩增目标基因与质粒载体的引物的5’端第1-15、16、17、18、19或20位间的磷酸二酯键为硫代修饰；目标基因和载体的正向引物，以及目标基因和载体的反向引物，的5’端第1-15、16、17、18、19或20位碱基序列互补配对。PCR扩增目标基因与质粒载体后，纯化PCR产物。碘酒选择性的断裂硫代修饰的磷酸二酯键，5’端1-15、16、17、18、19或20位硫代修饰的存在与碘酒热处理的共同作用会使DNA形成长20个核苷酸的3’单链突出端。本发明目标基因克隆不依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶、以及其它任何DNA修饰酶，操作通量大，可用于大规模基因克隆。

主权项

一种基于硫代修饰的碘酒裂解型基因克隆方法，其特征在于包括以下步骤：1)设计合成用于扩增目标基因与质粒载体的引物序列；引物序列的特征是：(1)5’端第1‑15、16、17、18、19或20位间的磷酸二酯键为硫代修饰；(2)扩增目标基因和质粒载体的正向引物的5’端第1‑15、16、17、18、19或20位间的碱基序列彼此互补配对，扩增目标基因和质粒载体的反向引物的5’端第1‑15、16、17、18、19或20位碱基序列彼此互补配对；(3)3’端下游碱基序列与待扩增DNA片段两端碱基序列配对；2)将用于扩增目标基因与质粒载体的正向引物与反向引物、目标基因与质粒载体的DNA模板分子、DNA聚合酶和4种脱氧核苷三磷酸的混合物dNTPs加入聚合酶链式反应缓冲液，进行反应；3)对扩增的线性化质粒载体PCR产物，用DNA限制性核酸内切酶Dpn I消化去除质粒模板；4)碘酒热处理PCR扩增的目标基因与线性化质粒载体DNA片断，碘酒选择性的断裂DNA中硫代修饰的磷酸二酯键，因此经碘酒热处理使得DNA片段的两端产生长为15‑20个核苷酸的3’突出端；5)将碘酒热处理的两种DNA片断混合，使二者的3’突出端杂交配对，形成含目标基因的带缺口重组质粒；6)将含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，37℃培养，修复重组质粒中的缺口，形成含目标基因的完整重组质粒；7)利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒的阳性克隆，从阳性克隆中抽提含目标基因的完整重组质粒DNA。