－种从金边蚂蟥中制取蛋白肽的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法。一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，包括以下步骤：消毒、磨浆、粗滤、微滤、超滤、碱溶、微波处理、离心、沉析、脱色、酶解、沉析、微滤、超滤、纳滤、浓缩和喷雾干燥。本发明提供用物理方法替代化学法分离酸性多肽，获得酸性多肽粗品，可作复配含酸性多肽的中成药或作纯化酸性多肽的前提物，分离率高，能很好保护其活性，无污染产生，达到清洁生产。

主权项

一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)先用清水冲洗鲜蚂蟥或解冻蚂蟥体表的污染物，然后移入浓度为3‰高锰酸钾溶液中，搅拌浸泡10‑15min；捞起后用清水洗掉高锰酸钾溶液，再将其移入浓度为5％氯化钠溶液中搅拌浸泡10min，捞起后用清水洗去其体表的盐份，再用去离子水冲洗1次，沥去水分，置于容器内；(2)将蚂蟥体表消毒灭菌后，按蚂蟥重量计算，加入3‰亚硫酸氢钠，1‰抗坏血酸和3倍去离子水拌匀，投入胶体磨中研磨，研磨温度控制在小于50℃，得到蚂蟥浆液；(3)将步骤(2)所得的蚂蟥浆液进行2次粗滤，合并2次粗滤的滤渣和滤液；(4)将步骤(3)所得滤液用可拦截分子量30000Da的30000膜进行微滤，收集微滤透过液；(5)将微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤选用10000膜；浓缩液加入上述粗滤渣中，透过液进行第2次超滤，选用5000膜；透过溶液并入前述之滤渣中，所得浓液即为富集含水蛭素溶液；(6)把粗滤渣和微滤浓缩液及超滤1浓液、超滤2之透液，调pH值为9，投入有搅拌装置，功率2‑10KW的微波罐中，用2KW功率微波升温，控控温小于60℃，微波20min，在55‑60℃保温20min，排出冷却；(7)将步骤(6)排出的溶液冷至45℃，用200目滤布三足离心机过滤，积累于滤布的滤渣用无离子水适量喷淋，所得滤液即为蚂蟥蛋白溶液；(8)将步骤(7)所得蚂蟥蛋白溶液，先用稀盐酸调pH值至6，然后再用10％冰醋酸溶解2％的壳聚糖溶液调pH值至5，将蛋白沉析出来，静置1‑2h，待溶液分层后弃去上层液再用400目滤布离心过滤，得湿蛋白，加入2‑3倍于湿蛋白量0.75％高锰酸钾溶液在35‑45℃温度下浸泡1.5‑2h，然后用400目尼龙滤布脱去高锰酸钾并用清水冲洗1次，用2‑3倍于湿渣的0.75％草酸溶液浸泡2‑3h，观察蛋白为白色时，即开始收集脱色蛋白；(9)将脱色的湿蛋白用无离子水稀释，待蛋白质浓度达到7％时，调pH值为9，加入底物质量3％的碱性酶搅拌均匀，置于带搅拌装置功率2‑10KW微波罐中，启动2KW功率，当酶解液升温到45℃时检测酶解液pH值，当pH值下降至7.5以上8以下时，补碱调至8.5，酶解液升温至55℃再检1次pH值，当pH下降不到7.8以下不再补碱，下降至7.8以下时补碱调至8，酶解液温度达到55℃时停止微波保留搅拌，待温度下降低于50℃后再启动2KW功率微波待酶解液升温至55℃，关掉微波保留搅拌，待酶解液温度下降至45℃以下时检测酶解液pH值，当pH低于8时补碱调至8，添加底物质量2.5％的胰酶，启动2KW微波，酶解液升温至50℃时，检查酶解液pH值，当pH下降低于或接近7时，补碱调至7.8，继续微波升温至55℃关掉微波，再检测pH，当pH下降至7.3以下补碱调至7.5，启动搅拌，待酶解液温度下降至45℃再启动微功率2KW，酶解液升温至55℃，保温5分钟后，启动功率10KW升温至85‑90℃，保温10分钟灭酶活；(10)将灭酶活后的酶解液排出，冷却至40℃，在搅拌状态下，缓慢添加用含20％冰醋酸溶解1.5％的壳聚糖溶液，使pH值调至5，沉析未酶解的蛋白及其他大分子杂质等，沉析液静置2小时，用400目滤布离心除去的沉析物即为蚂蟥蛋白，离心时先过滤上层液后过滤浓液；(11)将400目过滤所得的滤液，再用30000膜进行微滤；浓液合并入上述400目粗滤渣中；(12)步骤(11)所得微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤用10000膜，第2次超滤用5000膜，两次超滤的浓缩液合并进粗滤渣中；(13)将步骤(12)中超滤2所得透过液进行钠滤；(14)将步骤(13)中纳滤所得浓缩液，选用喷雾干燥法干燥，获得多肽；将步骤(10)的滤渣，步骤(11)微滤之浓液、步骤(12)超滤之浓液合并选用喷雾干燥法干燥，获得蚂蟥蛋白粉。