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Un método para detectar una secuencia diana en un polinucleótido en una muestra biológica, en el que la muestra puede contener también, o alternativamente, un segundo polinucleótido que comprende una segunda secuencia, en donde la segunda secuencia difiere de la secuencia diana por uno a 4 nucleótido(s), comprendiendo el método, i. Poner en contacto la muestra con un oligonucleótido bloqueador bajo condiciones de la reacción de extensión del cebador para permitir la hibridación del oligonucleótido bloqueador a la segunda secuencia y la secuencia diana, si está presente ii,. Poner en contacto la muestra en presencia del oligonucleótido bloqueador hibridado con al menos un cebador y una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' en condiciones tales que se produce la extensión del cebador dependiente del molde, en el que el cebador se hibrida con los polinucleótidos, si está presente, corriente arriba de la secuencia que hibrida con el oligonucleótido bloqueador; en el que el oligonucleótido bloqueador hibrida con la segunda secuencia lo suficiente como para impedir la amplificación de la segunda secuencia por la polimerasa, en el que el oligonucleótido bloqueador no comprende un nucleótido intercalante, en el que la hibridación del oligonucleótido bloqueador a la secuencia diana no afecta significativamente la amplificación de la secuencia diana por la polimerasa que carece de manera significativa de actividad nucleasa 5'-3' y además en la que el oligonucleótido bloqueador es totalmente complementario a la secuencia diana excepto para la posición de uno a 4 nucleótido(s). |
