一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法

摘要

本发明公开了一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法。其是将海洋生物加入裂解液与蛋白酶抑制剂后进行匀浆，离心，取上清液和沉淀物；将沉淀物进行低温破碎、超高速低温离心获取蛋白质提取液；再将蛋白质提取液进行两次丙酮沉淀，对蛋白质组样品纯化，再经还原、烷基化，从海洋生物组织中获得种类全面、浓度及纯度均较高的蛋白质组学样品。本发明工艺合理，操作可靠，制备科学，应用范围广，在对蛋白质带来极小破坏的情况下最大限度回收蛋白质组，并且对基于同位素标记绝对定量的鸟枪法蛋白质组液相色谱串联质谱测定进行了特别优化，对开展海洋蛋白质组学的相关研究具有较大意义。

主权项

一种用于海洋生物蛋白组学研究样品的制备处理方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：(1)样品预处理：取海洋生物于离心管中，加入裂解液，料液比1︰2～5(m/v)，加入蛋白酶抑制剂使其终浓度为0.5～1.2mM，用组织匀浆器充分打散后，离心，取上清液和沉淀物，上清液即为组织可溶性全蛋白溶液；(2)膜蛋白提取：将步骤（1）中得到的沉淀物采用Tris‑Hcl缓冲液重悬，重悬液进行低温破碎，离心，收集上清液,得到组织细胞膜蛋白的提取液；(3)丙酮沉淀：将步骤（1）、步骤(2)中得到的上清液合并，然后在合并的上清液中加入其体积4～6倍的预冷丙酮溶液，震荡混合，‑20℃条件下沉淀2～4h，离心，收集沉淀；(4)二次丙酮沉淀：将步骤(3)中得到的沉淀中加入其体积3～5倍的预冷丙酮溶液，震荡混合，‑20℃条件下沉淀1～2h，离心，收集沉淀；按上述步骤重复操作1～2次；合并沉淀；(5)总蛋白提取：将步骤(4)中得到的合并后的沉淀在常温下干燥后，溶解于裂解液中，料液比1︰2～5(m/v)，室温作用2～4h；离心，取上清液；上清液再次离心，弃沉淀，取上清液；合并上清液，即得组织的总蛋白溶液； (6)还原、烷基化：定量称取步骤(5)中得到的总蛋白溶液作为样品，加入其体积3～4倍的50mmol/L的NH₄HCO₃溶液，然后加入0.5mol/L 的DTT至终浓度为3～4mmol/L，室温孵育30～50min；然后再加入0.5mol/L 碘乙酰胺至终浓度为55～90mmol/L，室温避光孵育20～50min；再用50mmol/L的NH₄HCO₃冲洗1～3次，乙腈脱水，冻干，保存，得海洋生物蛋白组学样品。