一种乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒及其应用方法

摘要

本发明公开了一种乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒及其应用方法。其中试剂盒由表面带正电的磁性纳米微球、裂解吸附液、洗涤液I和II、洗脱液以及磁分离架构成。在利用磁分离法去收集到患者血清的游离DNA后，可进行荧光定量PCR检测及数据统计分析。血清游离DNA定量检测试剂盒的建立可为临床的个体化诊疗提供有价值的数据平台。

主权项

一种乳腺癌患者血清游离DNA定量检测试剂盒的应用方法，该应用方法不用于诊断疾病，其特征在于，包括如下步骤：(1)首先，在1.5ml离心管中加入100μl血液，再加入400μl裂解吸附液及10μl表面带正电的磁性纳米微球，混匀，20～60℃水浴放置10～15分钟；(2)然后，将离心管放在磁分离架上静置，磁分离后去上清液；(3)再加入500μl洗涤液I，涡旋洗涤20～30秒后，置于磁分离架上，静置1～2分钟，磁分离后去上清液；重复洗涤3次，并吸干离心管盖上的残留液；(4)继续加入500μl洗涤液II，涡旋洗涤20～30秒，静置1～2分钟，磁分离后去上清液；重复洗涤5次，去上清液后吸干离心管盖上的残留液；将离心管留在磁分离架上，打开盖子在室温下放置5～10分钟；(5)继续加入30μl洗脱液，用枪头将表面带正电的磁性纳米微球吹分散，20～60℃放置5分钟；磁分离后回收上清液，将回收的上清液在‑20℃保存或直接测定分析；(6)最后，取步骤(5)磁分离后回收的上清液进行荧光定量PCR检测；包括PCR扩增后检测方法的建立，利用荧光定量PCR方法对样本中含有的游离DNA含量的确定，及数据统计分析；所述定量检测试剂盒由如下组分构成：(1)表面带正电的磁性纳米微球；(2)裂解吸附液：所述裂解吸附液是体积比为5:1的水溶液和异丙醇的混合溶液；其中，水溶液的pH为6.5～6.8，含3.8M盐酸胍、1M NaCl、1％Tritonx‑100、0.5％SDS、10mM Tris、1mM EDTA；(3)洗涤液I：1M NaCl，0.5％SDS，60％乙醇；(4)洗涤液II：70％乙醇；(5)洗脱液：pH 7.0～7.25，10mM Tris1‑HCl；(6)磁分离架；所述表面带正电的磁性纳米微球是二氧化硅包裹的Fe₃O₄纳米粒子，且在溶液中的表面电位为正，具有超顺磁性，所述表面带正电的磁性纳米微球的平均粒径为50～10000nm；所述血清游离DNA的片段长度范围为100bp～800bp。