雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法

摘要

本发明提供一种雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法，利用多种细胞因子联合大环内酯类免疫抑制剂—雷帕霉素，将人外周血来源的单个核细胞通过体外诱导扩增，培养出大量的调节性γδT细胞。本发明整个诱导、扩增和富集过程简单，可行性强；本发明细胞培养周期短，成本低；诱导效率高，重复性好，可在调节性γδT细胞培养中的应用。本发明诱导的调节性γδT细胞活力好，具有较强的免疫抑制功能，能保证以后的进一步研究，具有很好的推广价值。

主权项

一种雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法，其特征在于，通过以下步骤实现：（1）人外周血单个核细胞制备：取外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备单个核细胞，用含10%胎牛血清的完全RPMI1640培养液重悬细胞；（2）调节性γδT细胞诱导扩增：细胞接种当日按第0天计算，第0天加入唑来膦酸激活γδT细胞，同时加入IL‑2、IL‑15、TGF‑β1和雷帕霉素培养诱导，在第3、6、9天分别进行半量换液，每次换液时均加入新鲜IL‑2、IL‑15、TGF‑β1和雷帕霉素，浓度同前，于第15天检测培养细胞中调节性γδT细胞的含量；其终浓度分别为2 μmol/ml的唑来膦酸、200 U/ml的 IL‑2、50 ng/ml的 IL‑15、8 ng/ml的TGF‑β1和100nM的雷帕霉素；（3）调节性γδT细胞含量的检测：采用流式细胞术，以γδTCR和Foxp3作为分子标记，γδTCR+为γδT细胞的表型特征，γδTCR+Foxp3+为调节性γδT细胞的表型特征，检测调节性γδT细胞在培养细胞中所占的比例；（4）调节性γδT细胞的富集：采用免疫磁珠分选方法分选γδTCR+细胞群，内包含调节性γδT细胞；（5）检测富集的调节性γδT细胞的免疫抑制功能：采用流式细胞术，通过CFSE细胞共培养试验检测分析诱导的调节性γδT细胞对新鲜外周血来源单个核细胞的增殖抑制作用。