一种结核杆菌IgG抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法

摘要

本发明公开了一种结核杆菌IgG抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法，包括TB-IgG酶标板、TB-IgG酶结合物溶液、底物A溶液、底物B溶液、TB-IgG临界对照溶液、TB-IgG阳性对照溶液和终止溶液、标本稀释液、浓缩洗涤液。本发明应用间接ELISA法检测结核杆菌IgG抗体，以减少假阳性或假阴性现象对临床诊断带来的干扰，并且使该试剂盒能够对结核杆菌进行快速、准确的检测，同时误差小、检测灵敏度高、对检测设备要求低。

主权项

一种结核杆菌IgG抗体酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于：(1)TB‑IgG酶标板的包被：1.1配制TB‑IgG包被液：用碳酸钠‑碳酸氢钠缓冲溶液将TB抗原溶液稀释成浓度为0.8μg/mlpH＝9.6的溶液；1.2包被：用步骤1.1制得的TB‑IgG包被液按100μl/孔对透明反应孔进行包被，并在2～8℃温度下静置24～30小时；1.3洗涤液制备：将体积含量为0.05％的吐温‑20、pH＝7.5的磷酸盐缓冲溶液与蒸馏水按体积比1:40混合均匀，制得洗涤液；1.4洗涤：用洗涤液连续洗涤包被后的酶标板至少1次，拍干；1.5封闭：向洗涤后的透明反应孔内按130μl/孔加入封闭液，所述封闭液为每1000ml纯水溶液中含NaHCO₃ 2.93g、Na₂CO₃ 1.59g、牛血清白蛋白10g，并在20～25℃条件下，封闭2.8～3.2小时；1.6甩出孔中的封闭液，干燥40h～48h，完成包被；(2)TB‑IgG酶结合物溶液的配制：2.1将3～8mg辣根过氧化物酶溶解在1ml双蒸水中，再加入21～22mg/ml的高碘酸钠溶液200μl，在室温18℃～25℃条件下混合均匀制备得到辣根过氧化物酶溶液；2.2再将辣根过氧化物酶溶液加入pH＝4.4的醋酸‑冰乙酸缓冲液，在2～6℃条件下透析16～20小时；2.3取抗人‑IgG加入pH＝9.6、碳酸钠含量为0.05mol/L的碳酸钠‑碳酸氢钠缓冲溶液，在2～6℃条件下透析16～20小时；2.4将透析后的辣根过氧化物酶溶液和抗人‑IgG溶液混匀，放入pH＝9.6、碳酸钠含量为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液中搅拌透析2.5～3.5小时，再加入4mg/ml的硼氢化钠溶液；2.5使步骤2.4得到的混合溶液通过葡聚糖凝胶G‑200柱，同时用pH＝7.1的磷酸盐缓冲溶液洗脱；2.6用小试管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板条进行检测，收集试管内的羊抗鼠板条显兰色的试管内产物，制得辣根过氧化物酶标记的抗人‑IgG；2.7将收集的所述辣根过氧化物酶标记的抗人‑IgG加入等量甘油混匀，制得酶结合物初溶液；2.8将氯化钠6g～8g、小牛血清白蛋白140ml～160ml、叠氮钠0.8g～1.2g溶解在纯水中，并定容至1000ml，制得酶稀释液；2.9将所述酶结合物初溶液与所述酶稀释液按1:6000～1:4000稀释，制得TB‑IgG酶结合物溶液；(3)底物A溶液的配制先将柠檬酸三钠4.16g～6.24g、柠檬酸7.76g～11.64g和乙酸钠7.13g～10.70g用纯水完全溶解，再加入1.52ml～2.28ml的冰乙酸和0.8ml～1.2ml的双氧水，最后用纯水定容至1000ml，制得底物A溶液；(4)底物B溶液的配制将0.8g～1.2g 3，3'，5，5'‑四甲基联苯胺溶解在8ml～12ml二甲基甲酰胺中，再加入520ml～780ml无水乙醇和272ml～408ml乙二醇，混匀，制得底物B溶液；(5)终止液的配制向900ml纯水中加入80～120ml硫酸，混匀，制得终止液；(6)TB‑IgG临界对照溶液的配制用1000ml纯水溶解氯化钠6g～8g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.2g～3.4g、KH₂PO₄0.16g～0.24g、氯化钾0.16g～0.24g、蔗糖40g～60g，叠氮化钠0.08g～0.12g，羊抗鼠IgG100μl～400μl，制得TB‑IgG临界对照溶液；(7)TB‑IgG阳性对照溶液的配制用1000ml纯水溶解氯化钠6g～8g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.2g～3.4g、KH₂PO₄0.16g～0.24g、氯化钾0.16g～0.24g、蔗糖40g～60g，叠氮化钠0.08g～0.12g，羊抗鼠IgG1ml～2ml，制得TB‑IgG阳性对照溶液；(8)标本稀释液的配制取NaCl 6g～8g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.5g～3.0g、KH₂PO₄0.1g～0.3g、KCl 0.1g～0.3g加入容量瓶，再加入适量纯水，使之溶解完全，取硫柳汞0.4g～0.6g，使之溶解完全，再取小牛血清白蛋白200ml加入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000ml，制得标本稀释液；(9)浓缩洗涤液的配制取NaCl 149.0g～151.9g、Na₂HPO₄.12H₂O 92g～98g、NaH₂PO₄.2H₂O 28g～22g加入容量瓶；先加适量纯水，使之溶解完全；再加入硫柳汞0.8g～1.2g，使之溶解完全；量取4ml～6ml吐温‑20加入容量瓶，搅拌均匀，以纯水定容至1000ml，制得浓缩洗涤液。