共表达PRRSV ORF3及ORF5双基因核酸疫苗的制备方法

摘要

本发明提供一种共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF3及ORF5双基因核酸疫苗的制备方法，该方法是通过RT－PCR方法分别扩增PRRSV ORF3及ORF5的全基因序列，并将2个基因插入哺乳动物真核表达载体pIRES的2个多克隆位点，获得重组质粒S－W－PIRES。将重组质粒转染COS1细胞，通过RT－PCR方法检测到PRRSV ORF3及ORF5基因的转录，通过免疫组化检测到目的蛋白的瞬间表达。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生GP3蛋白及GP5蛋白，使机体不断产生针对两者的抗体及细胞免疫反应，对猪体提供持久的免疫保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。

主权项

1.共表达PRRSV ORF3及ORF5双基因核酸疫苗的制备方法，其特征在于通过RT-PCR方法分别扩增PRRSV ORF3及ORF5的全基因序列，并将2个基因插入哺乳动物真核表达载体pIRES的2个多克隆位点，获得重组质粒S-W-PIRES的共表达PRRSV ORF3及ORF5双基因核酸疫苗，该核酸疫苗在哺乳动物细胞中同时表达PRRSV的GP3及GP5蛋白；制备步骤如下：1)ORF3及ORF5的扩增：根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列，设计了针对PRRSV山东省分离株SD1株ORF3及ORF5的引物，引物序列如下：ORF3的引物S1：5’-ATCGCTAGCCGCCACCATGGTTAATAGCTGTA-3’S2：5’-GAGGAATTCAGAAGAATGTAAATAATTCTCATCTG-3’预期扩增长度为852bp：ORF5的引物W1：5’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’W2：5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’预期扩增长度为702bp：在每条引物的5’端均含有限制性内切酶酶切位点，以SD1株的cDNA为模板，通过引物S1及S2扩增ORF3，通过W1及W2扩增ORF5基因；预期扩增长度为702bp；2)S-W-PIRES真核重组表达载体的构建：将ORF5的PCR产物W片段与pIRES重组质粒经Xba I和Not I双酶切，将ORF5插入pIRES，构建W-pIRES重组质粒，将W-pIRES及ORF3的PCR产物S片段经EcoR I和Nhe I双酶切后，将ORF3的PCR产物S片段插入W-pIRES，构建S-W-PIRES真核重组表达载体；3)S-W-PIRES真核重组质粒的转染：将S-W-PIRES转染COS1细胞，通过RT-PCR检测ORF3及ORF5的转录情况，通过免疫组化检测目的蛋白的表达情况，上述试验均证明了目的基因的转录及目的蛋白的表达；4)S-W-PIRES真核重组质粒的动物试验：将S-W-PIRES质粒免疫小鼠及猪，同时设空载体PIRES及生理盐水对照组，检测核酸疫苗免疫后动物体内针对GP3及GP5的ELISA抗体、中和抗体及淋巴细胞增殖反应，证明核酸疫苗S-W-PIRES在动物体内刺激产生针对GP3及GP5的抗体，中和抗体效价达1∶18.4，淋巴细胞增殖能力明显高于对照组。