制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法

摘要

本发明公开了一种制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，涉及抑制剂领域，包括以下步骤：制备NAMPT重组蛋白，使用还原剂还原NAMPT重组蛋白，还原蛋白与交联剂反应获得活性中心被封堵的交联NAMPT，配置第一蛋白溶液、和第二蛋白溶液，制备第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液，采用荧光光谱仪分别测定第一待分析溶液、第一对照溶液、第二待分析溶液和第二对照溶液的荧光强度，并计算第一待分析溶液和第二待分析溶液荧光强度下降的百分率。本发明的步骤比较少，操作较简单，成本比较低，反应过程受外界环境影响比较小，不仅重复性较好，而且结果比较准确。

主权项

一种制备交联NAMPT及筛选NAMPT抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备NAMPT重组蛋白；S2、按照摩尔份，将1份NAMPT重组蛋白加入20～100份还原剂中；在温度为20℃～25℃的条件下孵育0.5h～1.5h，得到粗蛋白；采用脱盐柱除去粗蛋白中的还原剂，得到预处理蛋白；S3、按照摩尔份，将1份预处理蛋白与2～5份1,4‑双(马来酰亚胺基)丁烷混合均匀，在温度为20℃～25℃的条件下静置反应1h～5h，采用脱盐柱除去未反应的1,4‑双(马来酰亚胺基)丁烷，得到交联NAMPT；S4、预置PBS缓冲溶液，将PBS缓冲溶液分为3份：第一PBS缓冲溶液、第二PBS缓冲溶液、第三PBS缓冲溶液，所述第一PBS缓冲溶液和第二PBS缓冲溶液的体积相同；向第一PBS缓冲溶液中加入NAMPT重组蛋白，形成浓度小于50μM的第一蛋白溶液；将第一蛋白溶液平均装入偶数支容积为500μL～2mL的第一石英管中，将所述第一石英管平均分为2组：A组、B组；向第二PBS缓冲溶液中加入交联NAMPT，配置浓度与第一蛋白溶液相同的第二蛋白溶液；将第二蛋白溶液平均装入偶数支容积为500μL～2mL的第二石英管中，每支第二石英管中的第二蛋白溶液的体积，与每支第一石英管中第一蛋白溶液的体积相等，将所述第二石英管平均分为两组：C组、D组；S5、配置浓度为0.5mM～1.5mM的待选择抑制剂溶液，向A组的每支第一石英管中加入体积不一的待选择抑制剂溶液，每支第一石英管中第一蛋白溶液的NAMPT重组蛋白的摩尔量：待选择抑制剂溶液的摩尔量为1:0～1:100；每支第一石英管加入待选择抑制剂溶液后混合均匀，在温度为20℃～25℃的条件下，静置5min～15min，得到第一待分析溶液；向B组的每支第一石英管中加入体积不一的第三PBS缓冲溶液，每支第一石英管中第三PBS缓冲溶液的体积，与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同，每支第一石英管加入第三PBS缓冲溶液后混合均匀，在温度为20℃～25℃的条件下，静置5min～15min，得到第一对照溶液；向C组的每支第二石英管中加入体积不一的待选择溶液，每支第二石英管中待选择抑制剂溶液的体积，与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同，混合均匀，每支第二石英管加入待选择抑制剂溶液后混合均匀后，在温度为20℃～25℃的条件下，静置5min～15min，得到第二待分析溶液；向D组的每支第二石英管中加入体积不一的第三PBS缓冲溶液，每支第二石英管中第三PBS缓冲溶液的体积，与A组对应的第一石英管中待选择抑制剂溶液的体积相同，每支第二石英管加入第三PBS缓冲溶液后，混合均匀，在温度为20℃～25℃的条件下，静置5min～15min，得到第二对照溶液；S6、使用荧光光谱仪测定第一待分析溶液的荧光强度、第一对照溶液的荧光强度、第二待分析溶液的荧光强度、第二对照溶液的荧光强度；S7、根据第一待分析溶液的荧光强度和第一对照溶液的荧光强度，计算第一待分析溶液荧光强度下降的百分率；根据第二待分析溶液的荧光强度和第二对照溶液的荧光强度，计算第二待分析溶液荧光强度下降的百分率。