一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法

摘要

本发明涉及一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，包括：功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物的制备、表面功能化修饰及表征；功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物/pDNA的制备；功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物/pDNA的基因转染效率的研究。本发明制备的载体用于基因转染具有易操作，转染条件简单，转染效率高，特异性强等优点，在癌症基因治疗等方面有良好的应用前景。

主权项

一种功能化聚酰胺‑胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，包括：(1)分别将1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液、N‑羟基琥珀酰亚胺NHS溶液加入羧基端甲氧基聚乙二醇mPEG‑COOH溶液中，搅拌反应2‑4h，得到活化的mPEG‑COOH；然后将活化的mPEG‑COOH加入到第五代聚酰胺‑胺树状大分子溶液中，反应12‑30h，得到功能化聚酰胺‑胺树状大分子溶液G5.NH₂‑mPEG₂₀；其中EDC和NHS与mPEG‑COOH的摩尔比为1.8:1，mPEG‑COOH与树状大分子的摩尔比为20:1；其中EDC溶液、NHS溶液为：称取4.0mg EDC和2.4mg NHS，分别溶于1mLDMSO中，得到；mPEG‑COOH溶液为：称取mPEG‑COOH 23.16mg,溶于5mL DMSO中得到；第五代聚酰胺‑胺树状大分子溶液为：称取第五代聚酰胺‑胺树状大分子G5.NH₂15.06mg，溶于5mL DMSO中；(2)将上述功能化聚酰胺‑胺树状大分子溶液G5.NH₂‑mPEG₂₀加入到氯金酸HAuCl₄·4H₂O溶液中，搅拌反应20‑30min，再加入硼氢化钠NaBH₄溶液，搅拌2‑4h，得到包裹纳米金颗粒的功能化聚酰胺胺树状大分子溶液{(Au⁰)₂₅‑G5.NH₂‑mPEG₂₀}DENPs；其中HAuCl₄·4H₂O与树状大分子的摩尔比为25:1，NaBH₄与HAuCl₄·4H₂O的摩尔比为5:1；(3)将端基分别为氨基和羧基的聚乙二醇NH₂‑PEG‑COOH溶液加入到6‑(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6‑MAL溶液中，搅拌反应6‑8h，得到MAL‑PEG‑COOH溶液；然后加入巯基端环状的精氨酸‑甘氨酸‑天冬氨酸氨基酸序列肽RGD‑SH溶液，搅拌反应10‑12h，得到RGD‑PEG‑COOH溶液；然后再分别加入EDC溶液、NHS溶液，得到活化的RGD‑PEG‑COOH；然后将活化的RGD‑PEG‑COOH加入第五代聚酰胺‑胺树状大分子溶液中，反应12‑30h，得到功能化聚酰胺‑胺树状大分子溶液G5.NH₂‑(PEG‑RGD)₁₀；然后按步骤(1)中的过程，得到活化的mPEG‑COOH，加入到G5.NH₂‑(PEG‑RGD)₁₀中，反应12‑30h，得到功能化聚酰胺‑胺树状大分子溶液G5.NH₂‑(PEG‑RGD)₁₀‑mPEG₁₀；其中NH₂‑PEG‑COOH、6‑MAL、RGD‑SH的摩尔比为1:1:1，EDC和NHS与RGD‑PEG‑COOH的摩尔比为1.8:1，EDC和NHS与mPEG‑COOH的摩尔比为1.8:1，mPEG‑COOH与树状大分子的摩尔比为20:1；(4)将上述功能化聚酰胺‑胺树状大分子溶液G5.NH₂‑(PEG‑RGD)₁₀‑mPEG₁₀中加入HAuCl₄·4H₂O溶液搅拌15‑30min，再加入NaBH₄溶液，搅拌2‑4h，得到包裹纳米金颗粒的功能化聚酰胺胺树状大分子溶液{(Au⁰)₂₅‑G5.NH₂‑(PEG‑RGD)₁₀‑mPEG₁₀}DENPs；其中HAuCl₄·4H₂O与树状大分子的摩尔比为25:1，NaBH₄与HAuCl₄·4H₂O的摩尔比为5:1；(5)将步骤(1)(2)(3)(4)所得的溶液进行透析、冷冻干燥处理，得到干燥的G5.NH₂‑mPEG₂₀，{(Au⁰)₂₅‑G5.NH₂‑mPEG₂₀}DENPs，G5.NH₂‑(PEG‑RGD)₁₀‑mPEG₁₀，{(Au⁰)₂₅‑G5.NH₂‑(PEG‑RGD)₁₀‑mPEG₁₀}DENPs；分别将G5.NH₂，G5.NH₂‑mPEG₂₀，{(Au⁰)₂₅‑G5.NH₂‑mPEG₂₀}DENPs，G5.NH₂‑(PEG‑RGD)₁₀‑mPEG₁₀，{(Au⁰)₂₅‑G5.NH₂‑(PEG‑RGD)₁₀‑mPEG₁₀}DENPs给它们命名为K0，K1，K2，K3，K4；(6)按照相应的N/P比，取K1，K2，K3，K4用无菌水稀释，并用无菌水稀释质粒，然后混合均匀，37℃孵育30min，得到不同N/P比的功能化聚酰胺‑胺树状大分子及其纳米复合物/pDNA；其中N/P比为树状大分子的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比，数值范围为1:1‑5；(7)将U87MG细胞种于24孔板上，于37℃、5％CO₂培养24h，更换成无血清的培养基，加入步骤(6)所得的功能化聚酰胺‑胺树状大分子及其纳米复合物/pDNA，混合均匀，在培养箱中孵育4h，然后将培养基换成有血清的培养基继续培养24h，检测基因转染效率。