重组大肠杆菌高效表达L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法

摘要

本发明提供了一种重组大肠杆菌高效表达L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法以及一种L-天冬酰胺酶Ⅱ。重组大肠杆菌高效表达L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法包括的步骤有：获得表达L-天冬酰胺酶Ⅱ的重组大肠杆菌；培养种子液；发酵培养；获得L-天冬酰胺酶Ⅱ；其中发酵培养的步骤采取分步发酵培养。本发明重组大肠杆菌高效表达L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法工艺简单、易于操作，并且产出量高、降低了生产成本。

主权项

一种重组大肠杆菌高效表达L‑天冬酰胺酶Ⅱ的方法，包括如下步骤：获得表达L‑天冬酰胺酶Ⅱ的重组大肠杆菌，所述表达L‑天冬酰胺酶Ⅱ的重组大肠杆菌的获得方法如下：从大肠杆菌中提取DNA，并以所述DNA为模板，扩增L‑天冬酰胺酶Ⅱ基因，所述扩增L‑天冬酰胺酶Ⅱ基因时所设计的引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物为5'TGCGGATCCCATTACCCAATATCA‑3'；所述下游引物为5'GAGCTCGAGGTACTGATTGAACT3'；将所述L‑天冬酰胺酶Ⅱ基因连接在表达质粒pET32a(+)上，得到重组质粒pET32a(+)‑LA；用所述重组质粒pET32a(+)‑LA转化感受态大肠杆菌，得到表达L－天冬酰胺酶Ⅱ重组大肠杆菌；将所述重组大肠杆菌接入培养基一中进行摇床培养，得到种子液，所述培养基一包含如下成分：蛋白胨8～20g/L、酵母粉2～10g/L、NaCl6～15g/L、氨苄青霉素40～100mg/L；将所述种子液按总接种量的5％～12％接入培养基二中进行分阶段发酵培养；其中，所述培养基二含有如下成分：葡萄糖10～15g/L、蛋白胨10～16g/L、酵母粉16～23g/L、甘氨酸0.5～0.9g/L、KH₂PO₄ 2.00～2.2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 12.12～15.54g/L，所述分阶段发酵培养是先在0～7小时内通入无菌空气，搅拌，进行第一阶段培养；在8～32小时内通入无菌空气，搅拌，且温度以0.3～1℃/h梯级降低至32℃进行第二阶段培养；在上述分阶段发酵培养过程中还添加有乳糖诱导剂，所述乳糖诱导剂在所述培养基二中的浓度为3～5g/L。