一种直接从发酵液中固定化单宁酶的方法

摘要

本发明公开了一种直接从发酵液中固定化单宁酶的方法。该方法包括：（1）以塔宾曲霉为产酶菌株发酵铁观音茶梗获得游离粗单宁酶；（2）以亲水性超顺磁性纳米颗粒为游离单宁酶固定化载体；（3）采用直接固定化、戊二醛交联以及碳二亚胺共价结合三种方法将游离单宁酶固定在纳米颗粒上获得流体状固定化单宁酶；（4）真空冷冻干燥流体状固定化单宁酶获得粉末状固定化单宁酶。本方法直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶，简单、快速的制备了磁性纳米固定化单宁酶。该固定化单宁酶具有良好的酶活力、存储稳定性、重复利用性以及磁操纵性能。

主权项

一种直接从发酵粗酶液中固定化单宁酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、产单宁酶菌株种子制备：将塔宾曲霉菌种活化，扩大培养获得发酵种子液；步骤二、单宁酶发酵培养基制备及单宁酶发酵：固体发酵基质中添加蔗糖、葡萄糖、硫酸铵和酵母浸膏作为外加碳氮源，润湿、搅拌均匀后高压蒸汽灭菌，冷却至室温接种塔宾曲霉种子液，搅拌均匀后恒温静置固态发酵获得单宁酶；步骤三、游离酶制备：发酵结束后，发酵物中加入柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液浸提培养基中单宁酶，减压真空过滤混合液收集滤过液获得游离单宁酶；步骤四、酶固定化载体制备：以FeCl₃和FeCl₂为原料，加热搅拌条件下加入浓氨水采用共沉淀法获得Fe₃O₄磁性纳米粒子，再经油酸反应包裹磁性纳米粒子表面获得亲油性、具有活性基团的纳米粒子，高锰酸钾改性油酸包裹的纳米粒子表面活性基团，搅拌加热使制备得到的流体状磁性纳米粒子后，磁分离后经真空冷冻干燥后获得粉末状、具有亲水性、表面羧基功能化的磁纳米载体；步骤五、单宁酶固定化及固定化酶制备：超声均匀分散磁性纳米载体于磷酸盐缓冲溶液中，将游离单宁酶与分散均匀的磁性纳米载体混合均匀进行直接固定化、戊二醛交联固定化或碳二亚胺共价结合固定化游离单宁酶；磁分离固定化酶，纯水洗涤数次至洗涤液呈中性，真空冷冻干燥流体状单宁酶获得干粉状固定化单宁酶。