一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用

摘要

本发明涉及一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系及其制备方法和一种单克隆抗体及其应用，其中抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系具体由以下方法获得：（1）用PRV制得抗原免疫BALB/c小鼠；（2）用免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合；（3）经筛选获得分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞。本发明采用Sepharose4FF层析柱纯化得到了高纯度的PR抗原，保证后续阳性克隆的筛选和抗体的产生，确立了间接ELISA法快速测定单抗的产生与效价，通过接种BALB/c雌性小鼠腹腔获取了大量PRV单抗，该抗体是针对PR病原的单一抗体，具有特异性强、纯度高、均一性好等优点，可用于PR的诊断和治疗，同时为其他类型单抗的制备提供了一定的技术借鉴。

主权项

一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系，其特征在于：由以下方法获得：（1）制备高效价的PR为免疫原伪狂犬病毒悬液接种到已长成单层的BHK‑13细胞上，35℃培养5～6d后，每隔3d连续收取培养液上清3次，将收集的病毒悬液浓缩40倍，并加入终浓度为1/3000的甲醛灭活病毒，将灭活的病毒悬液离心30min去沉淀，上清通过Sepharose 4FF层析柱进行纯化；具体纯化方法如下：选择BPG200/750的层析柱活化Sephrose4FF粉；洗涤，平衡后，加入纯化单抗室温偶联3h；洗涤，装柱；平衡缓冲液平衡柱子后开始循环上样，样品体积50mL，上样1h后平衡缓冲液洗涤柱子，收集峰值时流出的杂蛋白；甘氨酸缓冲液进行洗脱，峰值时流出液用含中和缓冲液的管接收；所述纯化单抗为RV单抗；（2）免疫BALB/c小鼠用50μl PR抗原溶于100μl PBS，与100μl完全弗氏佐剂混匀，皮下注射小鼠，之后每隔3周，用25μg PR抗原溶于100μl PBS，与100μl不完全弗氏佐剂混匀，皮下注射，作4次增强免疫后，隔3周进行抗原冲击：25μg抗原溶于150μl PBS，腹腔注射，3d后，取脾细胞；（3）用免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合将免疫小鼠的脾细胞与SP2骨髓瘤细胞同37℃预温的1ml 450g/L的PEG4000融合，融合后的细胞用RPMI‑1640不完全培养液重悬后接种于加有小鼠腹腔巨噬细胞饲养细胞的96孔板内，在HAT选择性培养液中培养，观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测；RPMI‑1640不完全培养液：含体积分数为20%的小牛血清和体积分数为 1%的选择培养基HAT；（4）间接ELISA筛选阳性克隆将FR按照1×10⁷ TCID50的病毒量接种于BHK‑21细胞，未接毒的BHK‑21细胞作为阴性对照，培养10h后，用37mg/L多聚甲醛固定10min，充分洗涤后，加入NH₄Cl作用10min，充分洗涤，吸干残液；加入单抗37℃作用1h，充分洗涤；FITC标记的山羊抗小鼠抗体作为二抗作用1h后，充分洗涤，用荧光显微镜观察信号荧光；（5）阳性杂交瘤细胞克隆通过间接ELISA法检测为阳性的融合细胞经过三次克隆，获得分泌抗PRV杂交瘤细胞。