主权项 |
一种高效分离脐带间充质干细胞的方法,其特征在于:包括如下步骤:1) 华通氏胶的分离:将采集瓶中采集液倒出,仅保留脐带在采集瓶中;加入质量百分比为75%的酒精将脐带完全浸没,并浸泡2分钟;再将脐带转移到培养皿中,用生理盐水清洗2次,直至脐带表面不含血迹;将清洗过的脐带两端去除,并去除动脉血管、静脉血管和羊膜,分离出华通氏胶,放入培养皿中用生理盐水清洗;清洗完成后将华通氏胶剪成1‑4mm<sup>3</sup>的小块,并转移至50ml离心管中;2)将剪碎的华通氏胶接种到2个T‑75培养瓶中,每瓶不少于1.0g,再向每个培养瓶中加入9ml完全培养基,将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO<sub>2</sub>培养箱中培养;3)换液:每5天换液一次,直至达到60–70%的融合率;然后将培养基分别倒入50ml离心管中,并标记,在2000rpm下离心5分钟,去除上清;向每个离心管中加入9ml新鲜的完全培养基,并充分混合均匀;将培养基从50ml离心管中转移到原来的培养瓶中,并在培养瓶上标记换液日期;将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO<sub>2</sub>培养箱中培养;每4‑5天在显微镜下观察生长情况,当细胞达到60%‑70%融合时进行收集;4)传代:将用过的培养基收集到50ml离心管中,在2000rpm下离心5分钟;再用10‑20 ml 的生理盐水清洗T‑75培养瓶1次;向清洗后的每个T‑75培养瓶中加入3ml预热到室温的质量百分比为0.125%的胰酶;在显微镜下观察,直至有80%的细胞变圆脱落漂浮,即用静置后的培养基上清终止消化,消化过程在室温条件下2分钟;将离心管中剩余组织块倒入1个新的T‑75培养瓶中,加入8ml完全培养基作为备份;用10‑20 ml 的生理盐水清洗一遍T‑75培养瓶,洗液也倒入50ml离心管中;用细胞滤器过滤细胞悬液去除细胞组织块;将过滤好的细胞悬液收集到一个新的50ml离心管中;取0.5ml过滤后的细胞悬液计数,测活力;根据计数和活力结果,按照8×10<sup>3</sup>/cm<sup>2</sup>‑1×10<sup>4</sup>/cm<sup>2</sup>的接种密度选择T‑175培养瓶或T‑75培养瓶;将需要的细胞300g离心10分钟,去除上清;在离心管中加入5ml的完全培养基吹散细胞,再加入20ml完全培养基充分混匀;将细胞悬液接种细胞到1个T‑175培养瓶中,将培养瓶水平放入 37℃,体积百分比为5%的 CO<sub>2</sub>培养箱中培养;每天在显微镜下观察生长情况,当细胞达到80%‑90%融合时进行收集;5)收集:将用过的培养基收集到50ml离心管中,将收集的培养基300g离心5分钟;用20 ml 的生理盐水清洗T‑175培养瓶1次,并向每瓶加入6ml预热过的质量百分比为0.125%的胰酶,在显微镜下观察,直至有80%的细胞变圆脱落漂浮,即用离心后的培养基上清终止消化,消化过程室温条件下2分钟;将终止的细胞悬液收集到一个50ml离心管中;用20 ml 的生理盐水清洗一遍T‑175培养瓶,洗液也倒入50ml离心管中,并将洗液300g离心10分钟;6)冻存: 用5ml完全培养基稀释细胞团块,再加入20ml培养基混合均匀;从细胞悬液中取1‑2滴进行细胞计数和活力测定,活力需达到85%以上,细胞数达到8x10<sup>8</sup>以上,取流式,流式检测细胞数需达到2x10<sup>6</sup>;将300g细胞悬液离心5min;在收集到的细胞团中加入2ml 完全培养基、并打散,再加入2ml 4℃预冷30分钟的含质量百分比20%的DMSO的冻存液,并混合均匀;将4ml细胞悬液加入到3个冻存管中,每管1.3ml,每管的细胞数为 2x10<sup>6</sup>;最后利用程序降温盒或程控降温仪冻存细胞。 |