一种测定细胞DNA损伤标志物γH2AX含量的酶联免疫测定方法

摘要

一种测定细胞DNA损伤标志物ɣH2AX含量的酶联免疫测定方法，其特征在于：是采用一种特异性ɣH2AX抗体及酶标二抗对目标蛋白ɣH2AX特异性夹心识别，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有荧光产物，可根据底物的荧光值实现对ɣH2AX定量测定的方法。并利用该方法定量检测出由于卷烟烟气暴露而导致的细胞中ɣH2AX的含量变化，从而达到评价卷烟烟气基因毒性的目的。与传统有机染料相比，酶标抗体具有以下优势：酶的催化频率高,能放大反应效果，提高检测灵敏度；酶在室温下性质稳定且价格便宜，适于大量分析。酶联免疫分析方法具有快速、准确、高通量、高灵敏等优点。

主权项

一种测定细胞DNA损伤标志物ɣH2AX含量的酶联免疫测定方法，其特征在于：是采用一种特异性ɣH2AX抗体及酶标二抗对目标蛋白ɣH2AX特异性夹心识别，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为荧光产物，可根据产物的荧光值实现对ɣH2AX定量测定的方法，具体步骤如下：1）                  实验试剂的配制，包括以下实验试剂：（1）细胞培养基，（2）4%多聚甲醛溶液，（3）PBS‑T缓冲液，（4）细胞膜通透液，（5）封闭剂，（6）混合一抗溶液，（7）混合二抗溶液，（8）底物A：取0.1 M、 pH=8.6的Tris‑HCl的缓冲液10 ml，加入0.0011 g鲁米诺，0.0008 g对碘苯酚为溶液A1；取0.1 M、 pH=8.6的Tris ‑HCl的缓冲液10 ml，加入2.6 μl30%的H₂O₂，为溶液A2；使用前溶液A1和溶液A2各取75 μl混匀使用；（9）底物B：用二乙醇胺（DEA）缓冲液配制0.0125 mmol/l的4‑甲基伞花基磷酸钠（4‑MUP）溶液；2）细胞培养：人肺癌细胞A549细胞株培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，于37 ℃，5％C0₂培养箱中培养，细胞生长至汇合率为70%‑80%时，用0.25％胰蛋白酶消化法进行细胞接种，96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μl细胞悬液，最终细胞接种密度为5000 个/孔,于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；3）卷烟烟气粒相物萃取液及气相物吸收液的制备：制备最终浓度为10 mg/ml的烟气粒相物萃取液，和与其浓度相当的烟气气相物吸收液；4）卷烟烟气染毒：使用细胞培养基将烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞培养24 h 后，吸去培养液，分别设置7个不同浓度的烟气粒相物或烟气气相物染毒组和一个空白对照组，每组6个平行样孔，烟气粒相物染毒组每孔加入100 μl不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液，烟气气相物染毒组每孔加入100 μl不同浓度梯度的烟气气相物吸收液，空白对照每孔加入100 μl 稀释培养液，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h；5）基于酶联免疫方法对细胞中ɣH2AX定量测定：(1)细胞固定：细胞染毒24 h后，小心移去培养基，用PBS溶液洗涤两次，每次至少5 min，以除去化合物染毒溶液，每孔加入100 μl的4%多聚甲醛固定细胞15 min；(2)固定好的A549细胞用PBS‑T洗涤2次，每孔加入100 μl通透液室温孵育15 min；(3)PBS‑T洗涤3次，滴加2% BSA封闭液37 ℃湿盒中孵育1 h；(4) 加入100 μl含有兔抗总H2AX抗体和小鼠抗ɣH2AX抗体，在37 ℃恒温培养箱中孵育2小时或4 ℃过夜；(5)PBS‑T洗涤3次，加入HRP标记驴抗鼠和AP标记的羊抗兔混合二抗溶液，在37 ℃恒温培育1小时；(6)PBS‑T洗涤3次，向微孔板中加入75 μl的辣根酶底物A，孵育50 min，再加入75 μl的碱性磷酸酶底物B，孵育30 min后经荧光酶标仪测定荧光强度值，分别在540 nm处激发，在600 nm处检测，以及在360 nm处激发，在450 nm处检测；    所述小鼠抗ɣH2AX抗体的最佳浓度为0.6‑1.0 μg/ml；HRP酶标记的驴抗鼠抗体稀释浓度为4‑6μg/ml；6）数据处理：试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入酶标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号；本实验在检测目标物ɣH2AX的同时，对细胞中总H2AX也进行了定量测定且不区分磷酸化标记，根据目标物ɣH2AX与总H2AX荧光检测信号的比值来确定H2AX的磷酸化程度。