一种针对甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）的RNA干涉载体及在病毒脱除中的应用

摘要

本发明涉及针对甘薯褪绿矮化病毒基因RNase3的干涉载体及其在病毒脱除中的应用。甘薯褪绿矮化病毒RNase3基因的干涉载体的构建方法，包括根据甘薯褪绿矮化病毒RNase3基因的核苷酸序列设计两对引物，利用PCR方法将RNase3基因克隆到T载体上，以RNase3-T为模板，分别用设计的两对引物进行PCR扩增，将获得的目的基因RNase3分别用KpnI和XhoI以及SacI和XbaI酶切后，以反向重复的方式分别克隆到pBlue NiRIntron载体的内含子两侧；利用SacI和KpnI双酶切pIntron-RNase3IR载体，回收含RNase3基因反向重复序列的目的片段RNase3IR，将该目的片段克隆到中间载体pROK219上。本发明针对甘薯上严重发生的SPCSV，成功构建了SPCSV的RNAi载体，并将RNA干扰与茎尖组织培养相结合，建立了甘薯脱毒技术新体系，有效提高了脱除SPCSV的效率和脱毒甘薯品种的产量。

主权项

一种针对甘薯褪绿矮化病毒的RNase3基因的干涉载体，其特征在于，构建方法包括以下步骤：（1）引物设计：根据甘薯褪绿矮化病毒RNase3基因的核苷酸序列设计两对引物，具体如下：RNase3‑KpnI‑5’：5'‑GCAGGTACCATGATTCCGATCTTTTCTGATG‑3'，RNase3‑XhoI‑3’：5'‑CGCCTCGAGTCAATTCAAATTTAGAGCTTCG‑3'；RNase3‑SacI‑5’：5'‑TGCGAGCTCATGATTCCGATCTTTTCTGATG‑3'，RNase3‑XbaI‑3’：5'‑CGGTCTAGATCAATTCAAATTTAGAGCTTCG‑3'；（2）甘薯褪绿矮化病毒RNA干涉载体的构建：利用PCR方法将甘薯褪绿矮化病毒的RNase3基因克隆到T载体上，命名为RNase3‑T，以RNase3‑T为模板，以RNase3‑KpnI‑5’和RNase3‑XhoI‑3’为引物，进行PCR扩增，将获得的目的基因RNase3用KpnI和XhoI双酶切后，将其克隆到pBlue NiRIntron载体内含子一侧的相应位点；采用相同方法，以RNase3‑T为模板，以RNase3‑SacI‑5’和RNase3‑XbaI‑3’为引物，进行PCR扩增，将获得的目的基因RNase3用SacI和XbaI双酶切后，将其克隆到pBlue NiRIntron载体内含子另一侧的相应位点，构建成含RNase3基因反向重复序列的载体，命名为pIntron‑RNase3IR；然后利用SacI和KpnI双酶切pIntron‑RNase3IR载体，回收含RNase3基因反向重复序列的目的片段RNase3IR，将该目的片段克隆到中间载体pROK219上，该片段位于35S启动子的下游、NOS终止子的上游，命名为pROKRNase3IR；用EcoRI和HindIII酶切pROKRNase3IR，回收包括35S启动子、RNase3基因反向重复序列和NOS终止子的目的片段35S‑RNase3IR‑NOS，将该目的片段克隆到植物表达载体pBIN19上，命名为pBINRNase3IR。