用于核酸扩增的链霉亲和素修饰聚苯乙烯微球的制备方法

摘要

本发明属于基因组测序领域，具体涉及一种应用于基因组测序核酸扩增的链霉亲和素修饰聚苯乙烯微球的制备方法。首先通过分散聚合方法制备出粒径为25微米的聚苯乙烯微球，然后对聚苯乙烯微球表面进行羧基化，羧基化后的聚苯乙烯微球与链霉亲和素交联从而获得。本发明采用分散聚合法成功制备出单分散PS微球，粒径为25微米并且分散系数低，并且本发明对PS微球的表面羧基化和链霉亲和素修饰的反应条件进行了系统性优化，从而得到了一种链霉亲和素引入量较高的聚苯乙烯微球。

主权项

一种链霉亲和素修饰聚苯乙烯微球的制备方法，其制备的微球可用于基因组测序文库制备中的核酸扩增，所述微球粒径为25微米，具体步骤如下：(1)将分散剂加入反应介质中，通入氮气；搅拌至均相体系；(2)将苯乙烯单体和引发剂加入反应体系中；将反应体系升温；然后在搅拌条件下进行恒温反应；冷却至室温、洗涤、干燥。所述反应介质选自水、乙醇、乙二醇单甲醚和甲醇的一种或者两种以上的任意组合。所述的分散剂为磷酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚丙烯酸、聚乙烯醇和羟丙基纤维素中的一种或者两种以上的任意组合。引发剂选自偶氮二异丁腈(AIBN)或者过氧化苯甲酰(BPO)的一种或两种的任意比例组合。(3)取另一容器病加入邻苯二甲酸酐(PA)粉末及一定量的溶剂，超声振荡10min，然后加入制备的聚苯乙烯微球，向反应瓶中通纯氮一段时间后，在搅拌状态下加入三氯化铝，再通纯氮3min后60℃下反应6小时，即得羧基化聚苯乙烯微球。。(4)取羧基化聚苯乙烯微球，加入乙磺酸缓冲液(MES)混合均匀后加入水溶性碳二亚胺类交联剂(EDC)和N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化，EDC浓度1.0‑1.5g/L，EDC与NHS比例1:1之间，室温条件下温和搅拌，时间控制在20min；离心洗涤，去上清，沉淀经0.1mol/LPBS重悬、振荡、超声处理后即得到活化的聚苯乙烯微球；取链霉亲和素溶于pH6.7的PBS缓冲液中，加入到经过活化的聚苯乙烯微球溶液中，室温条件下温和搅拌，反应时间3h；13000g离心20min，沉淀用含有0.05％Tween20的PBS重复洗涤后的微球经超声分散重悬于PBS缓冲液中，加入赖氨酸，室温轻微震荡30min，离心洗涤，即得。